要了解為什么傳統(tǒng) PCR 存在限制，務必要了解 PCR 反應過程中發(fā)生了什么?；?PCR 運行可以分為三個階段：

指數(shù)期

       每個循環(huán)積聚的產(chǎn)物準確加倍（假定 ** 反應效率）。該反應具有高度特異性和精確度。出現(xiàn)指數(shù)式擴增，因為所有試劑均新鮮可用，反應的動力學推動反應有利于擴增子加倍。

線性期（高變異性）

       隨著反應繼續(xù)，一些試劑因擴增而被消耗。反應開始減緩，并且每個循環(huán)的 PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺期（終點：使用傳統(tǒng)方法進行凝膠檢測）

       反應停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時間夠長，PCR 產(chǎn)物將開始降解。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每支試管或每個反應將在不同的時間點進入平臺期。在平臺期可以看到這些差異。在平臺期內(nèi)，傳統(tǒng) PCR 進行測量，又稱為終點檢測。 不依賴Ct值，無需標準曲線。杭州JUE對定量數(shù)字PCR原理

dPCR的基本原理

       目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。可以使用幾種不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設(shè)分子種群遵循泊松分布來估計不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應體系中目標分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計算，從而解決了多個目標分子存在于單個液滴中的可能性。 常州廣州永諾數(shù)字PCR解決方案準確度不完全依賴于擴增效率。

       在定量PCR時，我們常常糾結(jié)一個問題，究竟是相對定量還是***定量呢？如今，你無需糾結(jié)了，因為數(shù)字PCR（digital PCR）來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的***定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

       數(shù)字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的***定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進行結(jié)果判讀時*判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應受擴增效率的影響**降低，對PCR反應***物的耐受能力**提高；數(shù)字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。支持多重數(shù)字PCR，可選全中文分析軟件。

       CNV（Copy Number Variations，拷貝數(shù)變異）研究需要極高的定量精度以區(qū)別不同拷貝數(shù)之間的微小差異，測序方法適用于高于30%的變異率檢測，而qPCR的比較**辨在1.5倍左右，數(shù)字PCR通過直接計數(shù)目標基因與參照基因( 拷貝數(shù)為1的基因，例如RNaseP) 的數(shù)目，計算比值，直接得到目標基因的拷貝數(shù)可以達到極高的拷貝數(shù)分辨精度。

       除此之外，dPCR在病原微生物檢測、microRNA研究、基因表達研究、NGS測序文庫的***定量、表觀遺傳學直接相關(guān)的DNA甲基化定量檢測、ChIP定量鑒定等領(lǐng)域的應用都令人極為期待，而在轉(zhuǎn)基因成分鑒定、分子標準品精確定量、環(huán)境樣本檢測等具體的應用方向上，已經(jīng)有大量實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果證明了dPCR技術(shù)的優(yōu)良性能。

數(shù)字PCR技術(shù)是公認的液體活檢領(lǐng)域靈敏度比較好的檢測方法。杭州JUE對定量數(shù)字PCR原理

單次微滴生成*需2分鐘。杭州JUE對定量數(shù)字PCR原理

定量PCR和數(shù)字PCR的特點：

       5. 目前定量PCR已經(jīng)能實現(xiàn)高通量樣品條件下的自動化操作。   

       6. 數(shù)字PCR在單分子層面上的***定量，可以徹底擺脫對標準曲線的依賴而直接給出靶序列的拷貝數(shù)，提高了實驗結(jié)果在批內(nèi)和批間的穩(wěn)定性，甚至能用來對標準品進行定標。   

       7. 基于***定量的方式，數(shù)字PCR結(jié)果的高重復性和高精度可實現(xiàn)微小差異的基因表達分析，如等位基因的不平衡表達、單細胞基因表達分析、microRNA表達分析等等。所謂“微小差異”的標準一般而言是指表達水平的差異在2倍以內(nèi)。   

       8. 同等條件下，數(shù)字PCR在靈敏度方面擁有優(yōu)勢，使得該技術(shù)已成為**的液態(tài)活檢、病原微生物檢測、轉(zhuǎn)基因成分測定、宿主殘留DNA分析等的熱門技術(shù)。

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