熒光的產生：一此化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發態，當其從激發態再回復到基態時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發光）。熒光發射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發光；而一旦停止供能，發光（熒光）現象也隨之在瞬間內消失。可以引起發熒光的能量種類很多，由光激發所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。免疫熒光技術可以用于研究內臟移植和免疫抑制。CD3免疫組化

免疫熒光-實驗步驟：細胞爬片免疫熒光：在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。CD3免疫組化免疫熒光技術在免疫學研究中發揮重要作用，幫助揭示細胞和分子的功能和相互關系。

細胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號：細胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據樣本表達量進行摸索；3）一抗孵育時間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高；抗體孵育時間過長或溫度過高；清洗不充分；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。

細胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內信號轉導，細胞免疫熒光技術是利用免疫技術和熒光標記技術相結合，原理就是利用抗原-抗體反應之后，采用熒光標記，標記完成后，顯微鏡下觀察細胞內某種抗原成分的多少，從而做出一個定位研究，也可以為細胞內信號傳導提供一個明確的指導，細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點，是目前比較常用的組織學技術，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結合，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。免疫熒光技術在生物學研究、醫學診斷和藥物開發等領域具有普遍應用。

細胞免疫熒光：細胞種板與細胞爬片制備：1) 細胞密度在90%-95%左右，用預熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養基中，充分吹打，使之成單細胞懸液，計數。2)取細胞培養12孔板，在每個孔放爬片的位置根據爬片的大小，先在每個孔里準備放爬片的位置滴幾滴培養基，然后將爬片置于液滴上，壓緊，使爬片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起，防止加細胞懸液時爬片漂起，造成雙層細胞貼片。根據自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養板內。3)24h或者48h后，根據細胞生長速度快慢，觀察判斷細胞密度，約90%時進行細胞免疫熒光。免疫熒光技術可以通過熒光信號顯示和檢查細胞或組織內的抗原或半抗原物質。ALP免疫組化

免疫熒光技術可以用于研究細胞凋亡和細胞存活。CD3免疫組化

其他熒光物質：酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發出熒光，激發光波長為360nm，發射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經激發后也可發射特征性的熒光，其中以Eu3應用較廣。Eu3螯合物的激發光波長范圍寬，發射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。CD3免疫組化