作為時下的熱點技術,數字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨、平行的微反應單元(nL,納升級別)中,使得每個反應單元中盡可能含有1個模板分子,并在此基礎上進行擴增、檢測和分布統計,從而實現靶標分子的比較 計數。(圖:數字PCR技術原理)根據微反應單元的不同形式,數字PCR產品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前,市場上主要的數字PCR產品主要是基于微滴式和芯片式,如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統和ThermoFisher公司的QuantStudio系統等。與一、二代PCR技術相比,數字PCR具有很多優勢:一是特異性、靈敏性均有顯著提高;二是在不依賴內參和標準曲線的前提下,可直接得到比較 量化指標;三是微反應單元相互獨立、封閉,避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴增產物間的相互干擾,準確度和可重復性較高。三重ddPCR檢測體系存在的問題:不同位點檢測體系之間的cross-reactivity。蘇州雙螺旋生物儀器數字PCR市場前景
在使用dPCR進行轉基因檢測時,通常直接參照qPCR的方法。使用不同技術對相同樣品檢測時,兩種方法的靈敏度是否具有可比性成為關注的問題。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765(12板,每板765個微單元)芯片數字PCR分析儀測定標準物質ERM-AD413檢測轉基因玉米MON810。該小組應用dPCR技術評估在qPCR定義下的靈敏度數值,在拷貝數200-700之間,dPCR與qPCR的測量結果具有一致性。但與qPCR的靈敏度相比,dPCR在低于拷貝數200時有被低估的風險,在高于拷貝數1000時有被高估的風險。dPCR在同一陣列上同時測量轉基因和內源性靶點時,需要稀釋內源性靶點和轉基因靶點在合理拷貝數范圍內以保證dPCR測量結果的準確性。蘇州雙螺旋生物儀器數字PCR市場前景數字PCR主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法。
引物設計(DesignPrimers):引物長度(PrimerLength):18-25個堿基之間。短的引物更易于同靶序列結合,但過短的引物也更可能同基因組上的多個區域相結合而產生非特異性擴增產物。更長的引物會提高同靶序列結合的特異性,但過長的引物(>30bp)同靶序列結合速度變慢,降低結合率。引物長度和組成直接影響引物Tm值(PrimerMeltingTemperature)和退火溫度(AnnealingTemperatures)。引物的組成——GC%含量(GCContent):指引物總堿基中G和C堿基數量的百分比,該值應在40-60%之間。如果模板序列的GC含量較高,推薦使用較高Tm值的引物。
數字PCR平臺的評價指標有:分割單元數,熒光通道數,操作復雜性和污染風險。但是重要的是檢測準確性,評估數字PCR平臺的一種方法是使用多個數字PCR平臺互相驗證,另一種方法是使用定值準確的標準物質。目前的三代的PCR技術各有各的優缺點,也各有各的應用領域,并不是一代取代一代的關系。技術的不斷進步給PCR技術注入了新的活力,使其能解鎖一個又一個的應用方向,使核酸檢測更方便、更準確。目前dPCR儀器的價格仍然十分昂貴,但隨著系統加工工藝的改進以及使用較便宜的材料,聚合成更小的體積[556],其價格將會不斷的降低,使其應用到更多的檢測中。臻準推出新款數字PCR產品:AccuONE2.0數字PCR系統。
數字PCR技術的出現不是為了完全取代原有分子診斷技術,而是更好的補充和完善現有技術平臺。數字PCR為不同應用場景下的多樣化核酸檢測需求提供了新的思路,尤其是在臨床檢測方面,在 性疾病早期檢測、 疾病的伴隨診斷、生殖遺傳篩查等領域展現出良好的應用前景。國產數字PCR企業在商業化應用方面,也不斷“攻城略地”。新羿生物在檢測及 疾病伴隨診斷方面開發了一系列試劑盒,并積極推進注冊臨床試驗;領航基因聚焦在血流 (膿毒癥)及呼吸道 領域,相繼推出了多款病原菌檢測試劑盒;銳訊生物聚焦于檢測,2020年其產品獲得FDA緊急授權。除此之外,在公共衛生領域,國產數字PCR企業針對食源性致病菌、鼠疫、蟲媒病毒等,也推出多種檢測試劑盒。影響dPCR定量結果的因素:儀器采用的分散方式與數量、溶液稀釋方法、分散體積的準確性以及結果表達方式。華南地區微滴式數字PCR生命科學用品
數字PCR的兩大應用場景在于基因檢測、無創出生缺陷篩查。蘇州雙螺旋生物儀器數字PCR市場前景
近年來,全球各個地區特別是工業發達地區都把發展精細化學品作為傳統化工產業結構升級調整的重點發展戰略之一, 其化工產業均向著“多元化”及“精細化”的方向發展。精細化學品是指能增進或賦予一種(類)產品以特定功能或本身擁有特定功能的小批量制造和應用的、技術密度高、附加值高,純度高的化學品,是基礎化學品進一步深加工的產物。伴隨著我國國民經濟的不斷發展,作為為多個行業服務的儀器儀表批發;商品批發貿易(許可審批類商品除外);商品零售貿易(許可審批類商品除外);教學設備的研究開發;辦公設備耗材批發;生物技術開發服務;生物技術推廣服務;計算機批發;生物技術轉讓服務;農業科學研究和試驗發展;醫學研究和試驗發展;自然科學研究和試驗發展;水處理設備的研究、開發;食品科學技術研究服務;環保設備批發;辦公設備批發;行業,在過去的幾十年間得到了飛速發展。精細化工總產值占化工行業總產值的比例為精細化率,精細化率的高低在一定程度上體現了一個地區經濟發展水平、高科技進步程度等諸多方面。精細化工產品生產的主要原料是基礎化工產品。我國化工有限責任公司(自然)經過多年發展,已建立了較為完整的化工產業體系,化工產品品種齊全,一些重要原材料具備了較大的生產能力和產量基數,并有十余種主要化工產品產量居世界前列。蘇州雙螺旋生物儀器數字PCR市場前景
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