摘要: 本發明提供了一種磁性微球分離純化納豆激酶的方法。將表面偶聯有親和配基的磁性微球加入到納豆激酶的發酵液中，在室溫下緩慢攪拌充分混合，使納豆激酶特異性地吸附在磁性微球表面；采用磁鐵將吸附有納豆激酶的磁性微球從發酵液中分離出來，用緩沖溶液清洗一次去除雜質，再用解析液進行解析，收集到納豆激酶的洗脫液；***經過冷凍干燥得到納豆激酶產品。分離后納豆激酶的活力為８５％，純化因子為６．０。本發明具有周期短、操作簡單、生產成本低且易于規模化生產等優點。 利要求: 一種磁性微球分離純化納豆激酶的方法，其特征在于，所述的納豆激酶分離純化方法包括以下幾個步驟：（１）納豆激酶發酵液的制備從固體培養基上挑取納豆激酶的單菌落接入２０－１００ｍＬ的種子培養基中，搖床中培養１２－２４ｈ，按２％－６％ 接種量接入發酵液體培養基中，在２５－３７℃下發酵罐培養２４－４８ｈ，液體發酵結束后，通過離心除去菌體，得到納豆激酶發酵液；（２）親和配基在磁性微球上的固定化將自制的磁性高分子微球進行表面功能化修飾得到表面含有環氧功能基團的磁 性微球，在５０－８０℃條件下，以氫氧化鈉為催化劑，進行親和配基的固定化反應，獲得表面含有親和杭州質量分離純化微球

如何精確控制和大規模化生產裸眼看不到的納米微球并賦予這些材料的功能， 以滿足現代產業的需求是當今納米材料科學家**重要的研究方向。納米微球 的關鍵技術問題和研究方向如下： 1） 納米微球粒徑大小徑及粒徑分布精確控制關鍵技術: 納米微球的應用非常***,不同的應用需要不同性能的微球,很多**應用都 對微球的粒徑大小和均一性都有極高的要求，如液晶間隔物微球和導電金 球都要求能精確控制粒徑大小（平均粒徑精度控制在50納米以下），粒徑分 布滿足變異系數小于3%,. 因此不同材料組成的納米微球的精確粒徑大小和分 布本領域首要解決的關鍵技術問題 2） 納米微球的孔徑大小,孔徑分布和比表面精確調控關鍵技術: 在很多應用領域，不僅要嚴格控制微球材料、粒徑大小、分布和機械強度， 還要調控微球的比表面積、孔道結構等,如用于生物分離和分析的微球介質和 色譜填料，微球粒徑大小、均一性、納米孔道結構都會影響生物分子分離和 分析效果，因此如何調控微球孔道結構，比表面積也是關鍵技術之一。蘇州分離純化微球

微球是直徑在納米和微米尺度范圍的球型粒子。球形物體是自然界存在**穩定的物質形態， 它是三維幾何空間理想的對稱體，也是單位體積中所有立體形態中面積**小的。自然界大 到星球如地球，小到籃球，乒乓球，玻璃珠等都是球體。 地球直徑是1.28萬千米，而籃球 直徑是0.25米，1納米等于十億分之一米，相當于一根頭發絲橫切面的六萬分之一，如果拿 納米的微球與籃球相比，就相當于籃球與地球之比例。 如此之小的納米微球材料卻是現代 產業發展的重要基礎。

2.3.2懸浮聚合
懸浮聚合法是單體小液滴懸浮在水中的聚合方法，在磁性粒子、穩定劑和表面活性劑存在下、靠油溶性引發劑的作用使一種或幾種單體在磁性粒子表面聚合可將磁性粒子包裹在聚合物中。與乳液聚合相比，懸浮聚合單體液滴粒徑通常是微米級別的。Li等[17]合成一種新型的核殼式P(DVB-MAA)/Fe3O4納米復合微球，可作為分散模式的磁介導微觀粒子的固相萃取吸附劑。Fe3O4納米粒子通過溶劑熱法制備，P(DVB-MAA)通過懸浮聚合合成，微球的平均粒徑在300~700nm，微球殼層的P(DVB-MAA)厚度在10nm左右。該微球可用于水中微量的有機污染物的快速、高靈敏檢測。
2.3分散聚合
分散聚合是懸浮聚合的一種，也是一種特殊的沉淀聚合，反應之前單體、溶劑、穩定劑、引發劑等是均一的混合體系，當反應開始，聚合物達到一定分子量之后，聚合物逐漸從反應體系中沉淀出來。Zhang等合成了Fe3O4含量高達70wt%、且分布比較均一的P(St–GMA)/Fe3O4的納米復合微球。由于只有當磁性粒子在反應初期成核過程中捕獲，并聚合增長才能得到復合微球，因此此方法的磁含量往往不高，且該法需使用的溶劑多為有機溶劑，聚合物與有機溶劑的親和性導致聚合物沉淀出時鏈長較長，粒徑較大，限制了其應用。

磁性高分子微球的制備
目前制備磁性高分子納米微球的方法主要分為五類，其主要包括：包埋法、原位法、單體聚合法、界面沉積法及自組裝法。
2.1包埋法
包埋法是將聚合物溶解在含有磁性超微粒子的溶液中，然后加入大量的沉淀劑，通過交聯、絮凝、霧化、沉積、蒸發等手段使高分子物質沉析在磁性粒子表面形成具有核殼結構的復合微球。高分子物質與磁性粒子主要通過范德華力、氫鍵、螯合作用或共價鍵等作用力結合。Li等通過化學共沉淀法合成納米粒子Fe3O4磁核，以殼聚糖為包裹材料包被自制的磁核，采用乳化交聯法制備了具有核-殼結構的磁性高分子微球-殼聚糖磁性微球，并偶聯肝素配基得到了一種新型親和磁性微球。所得親和磁性微球具有較窄的粒徑分布、形狀規整，粒徑在50nm左右。將磁分離技術應用于凝血酶的分離純化，得到了較好的效果（酶比活達1879.71U/mg，得率85%，純化倍數11.057，為傳統柱層析法的兩倍）。Chi?riuc等將含Fe2+和Fe3+溶液逐滴加入殼聚糖的NaOH溶液中制的可用于負載頭孢霉素的磁性殼聚糖微球。
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前段時間科技日報總編劉亞東列出包括芯片，飛機發動機等在內的35項中國給人卡脖子的技術， 其中微球材料也是其中之一。大多數人可能很容易理解芯片和飛機發動機的技術難度及其重要性 ，但很少人可以理解微球為什么也這么重要這么難做。我們所熟知的宏觀球體如籃球，乒乓球， 玻璃珠是如此之普通，而微球只不過是把這些球體做到足夠“小”而已，為什么中國這么一個 大的一個***卻做不了。其實很多技術的難度都是因為“小”造成的。芯片之所以難做就是因 為里面的結構要精細控制到納米尺寸。乒乓球可以很容易通過模具做出來，而要把乒乓球做到 納米和微米范圍的尺度其實難度是很大的。在微觀尺度下，大家習以為常的宏觀工具和制作技 術已完全不適用，需要全新的技術手段，使得宏觀很容易的事情在微觀變成高不可攀的技術難 題。當然也正是因為小，讓微球材料性能得到大幅度的提升，比如說微球表面效應和體積效應，一個乒乓球直徑40毫米，重量2-3克。如果把乒乓球做到直徑40納米微球，由于1毫米是106納米，因此一個普通乒乓球就可以做出1018個直徑40納米微球。其表面積有5000多平米，相當與5個足球場大小，同樣重量的40納米微球與40毫米乒乓球相比表面積增加了1012倍，因此納米微杭州質量分離純化微球

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