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美國investigator雙光子顯微鏡

來源: 發(fā)布時(shí)間:2022-03-02

雙光子之源:飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,這要求極高的電場強(qiáng)度,而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,脈寬越窄,雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析,能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢:只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),所以雙光子成像更清晰。優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。美國investigator雙光子顯微鏡

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許多生物醫(yī)學(xué)成像方式,無論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子),都使用激光作為光源,并需要兼容的熒光染料。熒光染料有自己的激發(fā)波長,它們可以被單個(gè)光子以該激發(fā)波長的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個(gè)幾乎同時(shí)到達(dá)的光子,但每個(gè)光子的能量約為單光子能量的一半,即雙波長(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理,后者是雙光子顯微鏡原理。在對同一種熒光染料進(jìn)行成像時(shí),雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長,因此雙光子的散射較小(波長較長,散射較小),可以更深入地滲透到組織中。國外investigator雙光子顯微鏡分辨率是多少雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。

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目前,世界各國的腦科學(xué)研究如火如荼,中國的腦計(jì)劃也即將啟動。其中,關(guān)于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究成為重點(diǎn)研究方向,而如何打破尺度壁壘,融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動與大腦整體的信息處理和個(gè)體行為信息,是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日,由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭,聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系、工學(xué)院以及中國人民******醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團(tuán)隊(duì),在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中報(bào)道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0,其成像視野是該團(tuán)隊(duì)于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍,同時(shí)具備三維成像能力,獲取了小鼠在自由運(yùn)動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像,并且實(shí)現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個(gè)月的追蹤記錄。

隨著技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,結(jié)合它的特點(diǎn),大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。深要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,大致可從兩個(gè)方面入手,裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,我們可以把激光束變得更細(xì),使能量更加集中,就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,解決這個(gè)問題,我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞,所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫,這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,又能不損傷細(xì)胞,使掃描能更好地進(jìn)行。雙光子顯微鏡非常適合對細(xì)胞組織進(jìn)行長時(shí)間在體成像。

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雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景,首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像,在亞微米級成像,此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似;雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí)、在體、原位、無創(chuàng)地,根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性,區(qū)分成像;雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像,在無造影劑的前提下,利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。雙光子顯微鏡技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力,該領(lǐng)域還未形成標(biāo)準(zhǔn)和體系,需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐,通過研究人體基于多光子成像技術(shù),進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息,找到與疾病的細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、診斷和***特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系,共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制,篩選鑒定**、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù),建立全新的多光子細(xì)胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫,定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。如果已經(jīng)有了飛秒光,就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺,只需分光即可。美國investigator雙光子顯微鏡

雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。美國investigator雙光子顯微鏡

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,這一波段的光對***細(xì)胞和組織的光損傷小,適用于長時(shí)間的研究;☆穿透能力強(qiáng):相對于紫外光,可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,因而受生物組織散射的影響更小,解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題;☆高分辨率:由于雙光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,雙光子吸收只局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi);☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象;☆熒光收集率高:與共聚焦成像相比,雙光子成像不需要光學(xué)濾波器(共焦***),這樣就提高了對熒光的收集率,而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高;☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長,因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,較大降低了散射的干擾;☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究;美國investigator雙光子顯微鏡