通過并行化不同激光波長的激光掃描，研究人員增加了在相同時間內可以成像的體積，同時保持了高的時間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號熒光探針，將神經元群體的活動標記為兩種不同的顏色，同時激發兩種不同波長的探針，從而實現了兩種顏色的并行數據記錄。為了實現三維空間成像，研究人員還在兩個激光束上配置了快速變焦系統，即一個電透鏡和一個空間光調制器。因此，可以以10Hz的速度同時記錄10個500微米和500微米的平面，覆蓋600微米的深度，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結構，體積內可以記錄2000多個神經元。雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當中；美國雙光子顯微鏡ultima

雙光子顯微鏡的應用由于適合動態成像，雙光子顯微鏡一經問世便很快應用于神經科學、遺傳發育、藥物代謝等領域。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對***神經細胞的形態結構、離子濃度、細胞運動、分子相互作用等進行直接成像監測，而且能夠進行光裂解、光轉染和光損傷等光學操縱。同時，雙光子顯微鏡能動態監測**在體內的生長和轉移，并可對**治療過程中*細胞的變化進行實時觀測和評估。隨著光學技術、熒光探針技術、計算機成像技術的發展，雙光子顯微技術會得到更大提升和更廣的應用，未來不僅用于基礎研究，也將擴展到臨床應用。進口激光熒光雙光子顯微鏡原理雙光子顯微鏡角膜成像。

雙光子顯微成像的在生物醫學研究和醫療領域應用有較大的應用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進行細胞和組織結構成像，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似；雙光子顯微成像能夠實時、在體、原位、無創地，根據不同物質組份的光譜特性，區分成像；雙光子顯微鏡能夠進行生化指標成像，在無造影劑的前提下，利用自發熒光、二次諧波、熒光獲得活細胞生化信息。雙光子顯微鏡技術在醫療診斷應用中具有巨大的潛力，該領域還未形成標準和體系，需要系統的醫學研究與龐大的醫療數據加以支撐，通過研究人體基于多光子成像技術，進行細胞結構、生化成分、微環境、組織形態、代謝功能的影響信息，找到與疾病的細胞學、分子生物學、組織病理學、診斷和***特征的關聯關系，共同探究生理病理基礎和分子細胞生物學機制，篩選鑒定**、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據，建立全新的多光子細胞診斷的完整數據庫，定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設備的產品標準。

從雙光子的原理和特點，我們可以清楚地得出雙光子的優點:☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發光源，因此該波段的光對細胞和組織的光損傷很小，適合長期研究；☆穿透能力強:與紫外光相比，可見光和近紅外光的穿透能力更強，因此受生物組織散射的影響更小，解決了生物組織深層物質的層析成像問題；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小，只能在焦平面很小的區域激發熒光，雙光子吸收被限制在焦點處體積約為波長三次方的范圍內；☆漂白區域小:由于激發只存在于交點處，焦點外的區域不會發生光漂白；☆熒光收集率高:與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片(共焦)，提高了熒光收集率，直接導致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長，瑞利散射產生的背景噪聲*為單光子激發產生的1/16，減少了散射的干擾；光子躍遷具有很強的選擇性激發，因此可以用來對生物組織中的一些特殊物質進行成像；雙光子顯微鏡觀察到的現象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發的鈉離子作用電勢。

雙光子的來源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎獲得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因為激光而得到實驗驗證，但WinfriedDenk用了近30年才發明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要理解非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生的非線性過程，需要極高的電場強度，電場取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只有激光脈沖寬度。基于以上分析，能夠輸出高重復率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光已經成為雙光子顯微鏡的標準激發光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優勢:雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光強較低，無法激發，所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?進口激光熒光雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗；美國雙光子顯微鏡ultima

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。美國雙光子顯微鏡ultima