雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線(xiàn)性過(guò)程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線(xiàn)性過(guò)程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說(shuō)明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡中，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè)，并且連焦平面外的熒光信號(hào)也不會(huì)有。國(guó)外2PPLUS雙光子顯微鏡分辨率

在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中，她們將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過(guò)位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制。同時(shí)，她們用數(shù)字微陣列光處理器，以不同的頻率同時(shí)調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強(qiáng)度，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”。來(lái)自所有子區(qū)域光束會(huì)在焦點(diǎn)處會(huì)聚干涉，通過(guò)監(jiān)測(cè)焦點(diǎn)激發(fā)的雙光子信號(hào)隨時(shí)間的變化情況，并進(jìn)行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線(xiàn)”的貢獻(xiàn)信息，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)一半子區(qū)域波前的并行測(cè)量。對(duì)另一半子區(qū)域重復(fù)這一測(cè)量過(guò)程，從而獲得整個(gè)入射波前的信息并進(jìn)行校正。該方法耗時(shí)很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測(cè)量和校正，無(wú)需復(fù)雜的計(jì)算，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類(lèi)型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場(chǎng)范圍內(nèi)的成像質(zhì)量。該方法無(wú)疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物、醫(yī)學(xué)問(wèn)題提供了可行性方案。美國(guó)激光雙光子顯微鏡價(jià)位這種雙光子顯微鏡的視場(chǎng)是普通顯微鏡的10倍。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢(shì)呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來(lái)，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、觀察！由于電磁波的波長(zhǎng)越短，粒子性越強(qiáng)，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長(zhǎng)波長(zhǎng)激光，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對(duì)細(xì)胞的毒性。除此之外，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng)，所以?huà)呙璧木_度極高，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過(guò)單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì)：雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過(guò)1毫米。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有較強(qiáng)度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā)，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔，提高了熒光檢測(cè)效率。

通過(guò)對(duì)微型光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì)，F(xiàn)HIRM-TPM2.0成像視野擴(kuò)大至420×420平方微米，微型物鏡的工作距離擴(kuò)展至1毫米，以實(shí)現(xiàn)非侵入式成像；嵌入了可拆卸的快速軸向掃描模塊，實(shí)現(xiàn)了180微米深度的三維體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像。該模塊由一個(gè)快速的電動(dòng)變焦透鏡和一對(duì)中繼透鏡組成，在不同深度成像時(shí)保持放大倍率恒定。其中，變焦模塊重量1.8克，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭還可整體即時(shí)拔插，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)動(dòng)物的干擾。在重復(fù)裝卸探頭追蹤同一批神經(jīng)元時(shí)，視場(chǎng)旋轉(zhuǎn)角小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。國(guó)外bruker雙光子顯微鏡光刺激

雙光子顯微鏡使用的是可見(jiàn)光或近紅外光作為光源。國(guó)外2PPLUS雙光子顯微鏡分辨率

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實(shí)驗(yàn)中，時(shí)間分辨率主要是受OPO輸出可見(jiàn)光激光功率的限制。盡管在單點(diǎn)掃描系統(tǒng)中，v2PE激發(fā)會(huì)使得空間分辨率提高，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率，這主要是多聚焦成像和單點(diǎn)掃描技術(shù)之間的差異造成的。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE，引入圖像掃描技術(shù)可以進(jìn)一步提高空間分辨率，這種技術(shù)需要通過(guò)在陣列前引入額外的微透鏡陣列來(lái)實(shí)現(xiàn)。除此之外，由于可見(jiàn)光區(qū)域的共振效應(yīng)，可能會(huì)產(chǎn)生光漂白，因而為了延長(zhǎng)觀察時(shí)間，系統(tǒng)還需要對(duì)激發(fā)強(qiáng)度和曝光時(shí)間做進(jìn)一步優(yōu)化。國(guó)外2PPLUS雙光子顯微鏡分辨率