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國內2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

來源: 發布時間:2024-12-13

光學顯微鏡從1590年發明以來,不斷發展,促進生命科學日新月異的發現,幫助人類逐層打開生命本質的大門。同時,生命科學的發展不斷給光學顯微鏡提出新的要求,促使成像理論和技術持續更新迭代。科學進入21世紀,人們已經不滿足于在體外研究細胞和組織,需要能夠更真實地探索生命,在體內實時觀察細胞的發生和變化。此時,雙光子顯微鏡進入了科學家的視野。在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,然后發射出一個波長較短的光子,其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發熒光分子是相同的(圖1)。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),在單光子激發時,在波長為350nm光的激發下發出450nm熒光;而在雙光子激發時,可采用700nm的激發光得到450nm熒光。用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重煥新生。國內2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

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細胞內鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當個細胞興奮時,產生了一個電沖動,此時,細胞外的鈣離子流入該細胞內,促使該細胞分泌神經遞質,神經遞質與相鄰的下一級神經細胞膜上的蛋白分子結合,促使這一級神經細胞產生新的電沖動。以此類推,神經信號便一級一級地傳遞下去,從而構成復雜的信號體系,終形成學習、記憶等大腦的高級功能。在哺乳動物神經系統中,鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色。靜息狀態下大部分神經元細胞內鈣離子濃度約為50-100nM,而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經遞質的過程必不可少。眾所周知,只有游離鈣才具有生物學活性,而細胞質內鈣離子濃度由鈣離子的內外流平衡所決定,同時也受鈣結合蛋白的影響。細胞外鈣離子內流的方式有很多種,其中包括電壓門控鈣離子通道、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體(nAChR)和瞬時受體電位C型通道(TRPC)等。神經元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現出來,以反映神經元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關的腦細胞。國內2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。

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雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應波長在1000nm-1400nm之間。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的,但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點:1.生物組織對紅外光的吸收弱,對可見光吸收強。類似的,平時用手電筒照射手指,會看到手通透紅亮,也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方。類似的,早晨的太陽非常紅,也就是因為長波長的紅光穿透力更強。這兩點共同導致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢,鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍,而近紅外相比可見光穿透更深,對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,鈦寶石飛秒可調諧激光器位于平臺較左邊。從雙光子到三光子科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年,ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發明了三光子顯微鏡,如果雙光子吸收可行,那么三光子看起來也是自然的發展方向。三光子成像使用更長的波長,大約在1.3和1.7微米,其成像深度也比雙光子更深,目前記錄約為2.2毫米,人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖,而傳統的鈦寶石激光器難以達到這些要求,但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡將得到更大的發展與更廣的應用。

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從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優點:☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發光源,這一波段的光對***細胞和組織的光損傷小,適用于長時間的研究;☆穿透能力強:相對于紫外光,可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,因而受生物組織散射的影響更小,解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題;☆高分辨率:由于雙光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的區域內可以激發出熒光,雙光子吸收只局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內;☆漂白區域小:由于激發只存在于交點處,所以焦點以外的區域都不會發生光漂白現象;☆熒光收集率高:與共聚焦成像相比,雙光子成像不需要光學濾波器(共焦***),這樣就提高了對熒光的收集率,而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高;☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長,因而瑞利散射產生的背景噪聲只有單光子激發時的1/16,較大降低了散射的干擾;☆光子躍遷具有很強的選擇激發性,所以可以對生物組織中一些特殊物質進行成像研究;雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應用;國內2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

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許多生物醫學成像方式,無論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子),都使用激光作為光源,并需要兼容的熒光染料。熒光染料有自己的激發波長,它們可以被單個光子以該激發波長的光子能量激發(E=hv=h*c/λ);或者是兩個幾乎同時到達的光子,但每個光子的能量約為單光子能量的一半,即雙波長(0.5E->2λ)。前者是單光子顯微鏡原理,后者是雙光子顯微鏡原理。在對同一種熒光染料進行成像時,雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長,因此雙光子的散射較小(波長較長,散射較小),可以更深入地滲透到組織中。國內2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野