過柱法DNA提取的工作原理:獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶,然后基因組DNA在高鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜,再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟,抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物,蛋白等雜質去除,較后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。1、采用離心吸附柱和緩沖液系統。樣品裂解后,DNA在高鹽條件下與硅膠膜結合,在低鹽、高PH值時從硅膠膜上洗脫下來。2、破壞紅細胞,通常利用紅細胞與白細胞膜結構的差異,先使紅細胞裂解,經離心后收集白細胞。3、白細胞裂使膜蛋白和核的蛋白變性,游離DNA,通常是采用離子型表面活性劑使蛋白質變性。4、除去變性蛋白質:通常采用蛋白沉淀劑沉淀變性蛋白質,使DNA留在上清液中。5、在高鹽環境下使DNA從有機溶劑(如無水乙醇)中析出。DNA提取的原則,保證核酸一級結構的完整性。天津血清RNA提取試劑研發
DNA提取方法:核酸(nucleicacid)在生物界中堪稱主宰,是一類非常重要的生物大分子,它在生物的繁衍、發育、維持、衰老和死亡等一切生命活動中扮演著重要的角色,目前,核酸已成為生物化學、遺傳學以及其他有關生命學科的熱門研究課題,其覆蓋面之廣、進展之速為其他學科所望塵莫及。而進行核酸研究的首先個前提就是能夠將核酸從眾多紛繁復雜的生物大分子中提取出來,并純化到一定程度,以便進行相應的科學研究和實際應用。DNA提取原則:保證DNA一級結構的完整性;提取的DNA樣品中不應存在對酶存在抑制作用的有機溶劑及過高濃度的金屬離子;其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到較低程度;排除其它核酸分子(RNA)的污染。成都無需氯仿RNA提取可測序若DNA分子量小或一片模糊,表明DNA有降解。
DNA提取方法:一.酚抽提法:先用蛋酶K、SDS破碎細胞,消化蛋白,然后用酚和酚-氯萃取,高速離心后取上清,所得DNA大小為100-150kb二.甲酰胺解聚法:破碎細胞同上,然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質與DNA的結合,再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。三.玻璃棒纏繞法:用鹽酸胍裂解細胞,將裂解物鋪于乙醇上,然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪,DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。四.異丙醇沉淀法:基本同1法,只用二倍容積異丙醇替代乙醇,可去除小分子RNA(在異丙醇中可溶狀態)五.表面活性劑快速制備法:用TritonX-100A或NP40表面活性劑破碎細胞,然后用蛋白酶K或酚去除蛋白,乙醇沉淀或透析。六.加熱法快速制備:加熱96℃-100℃,五分鐘,然后離心后取上清,可用于PCR反應。七.堿變性快速制備:先用NaOH作用20分鐘,再加HCI中和,離心后取上清,含少量DNA。
什么是RNA提取?RNA提取是指從樣品中純化RNA的過程。RNA提取的常規方法稱為硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取。Guanidiniumthiocyanate使蛋白質變性。此外,它破壞水分子的氫鍵并用作離液劑。RNA提取中使用一種特殊試劑,稱為三試劑。它含有硫氰酸胍、苯酚和乙酸鈉。RNA提取的基本步驟的目的與DNA提取的目的相似。1.用冰冷的PBS洗滌細胞以維持細胞的滲透壓。2.吸出細胞并用Tri-reagent勻漿樣品。3.加入氯仿并搖勻。4.離心可能會出現三層。頂層是透明的水層。中間層或界面包含沉淀的DNA。底層是有機層,呈粉紅色。5.除去水層并加入異丙醇。離心可能會產生沉淀。6.用75%乙醇清洗沉淀。空氣干燥顆粒。7.用TE緩沖液或水溶解沉淀。DNA提取的原則,核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子。
DNA提取的基本步驟:1.細胞裂解與細胞裂解緩沖液裂解細胞膜;2.脂質被洗滌劑和表面活性劑分解;3.通過添加蛋白酶消化蛋白質;4.通過添加RNase消化RNA;5.通過加入濃鹽然后離心分離細胞碎片、消化蛋白質、脂質和RNA;6.用冰冷的乙醇或異丙醇乙醇沉淀DNA。醋酸鈉的離子強度可用于改善沉淀。沉淀的DNA在較終溶液中呈線狀。酚-氯仿萃取也可用于從蛋白質中分離DNA。在這里,苯酚使樣品中的蛋白質變性,DNA在提取結束時保留在水相中。而且,在有機相中,您可以找到變性的蛋白質。另一種提取DNA的方法是微柱純化。在這里,DNA與柱子的結合取決于緩沖液的pH值和鹽濃度。DNA提取的原則,其他核酸分子,如RNA,也應盡量去除。上海核酸RNA提取
RNA提取是從細胞或組織中分離RNA的過程。天津血清RNA提取試劑研發
骨組織RNA提取之其它骨組織破碎方法:取出吸附柱RA,放入一個RNasefree離心管中,根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50μlRNasefreewater(事先在70-90℃水浴中加熱可提高產量),室溫放置1分鐘,12,000rpm離心1分鐘。如果預期RNA產量>30μg,加30-50μlRNasefreewater重復步驟12,合并兩次洗液,或者使用首先次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高15–30%,但是濃度要低,用戶根據需要選擇。天津血清RNA提取試劑研發
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