反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項(xiàng)，引物的選擇，OligodT：選擇OligodT時(shí)，要求RNA必須有PolyA，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，所以對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，較好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。特異性引物：特異性引物只能用你設(shè)計(jì)引物時(shí)的下游引物做RT，引物設(shè)計(jì)質(zhì)量影響RT的結(jié)果，而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以按照說(shuō)明書(shū)按照一個(gè)溫度做不是較佳選擇，一般不推薦。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)反應(yīng)過(guò)程中需控制反應(yīng)溫度，時(shí)間和pH值等指標(biāo)。成都一體化逆轉(zhuǎn)錄報(bào)價(jià)表

miRNA逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)法：首先需要進(jìn)行RNA樣品制備，可選的方法有：離心柱法抽提（不必去除gDNA）；傳統(tǒng)Trizol法抽提（需要去除gDNA）。miRNA正向引物：需要分別設(shè)計(jì)。是否采用通用引物視情況而定，正向引物與通用反向引物不會(huì)形成二聚體時(shí)才能用。取200ul的PCR管，根據(jù)所得每組RNA的濃度C，每孔加入1000ng總RNA，按公式1000ng/C計(jì)算出所需RNA的體積x。然后按建議的20μL反應(yīng)體系說(shuō)明，依次向200μL的PCR管內(nèi)加入下列試劑：加樣結(jié)束后，移液器吹打混勻，低速離心數(shù)秒。將逆轉(zhuǎn)錄PCR管放入PCR擴(kuò)增儀內(nèi)，調(diào)整參數(shù)：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)），4℃∞。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行熒光定量PCR或放入-20℃冰箱保存。說(shuō)明：此處可以選擇U6下游引物作為U6的逆轉(zhuǎn)錄引物，注意相應(yīng)地調(diào)整無(wú)酶水的體積和反應(yīng)溫度。南京彩色逆轉(zhuǎn)錄混合供貨商實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)需要經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

人體中也有逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，比如端粒的復(fù)制。端粒（telomere）是染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由重復(fù)的DNA序列（TTAGGG）和核的蛋白組成，可以保護(hù)染色體末端，維持基因組完整性。端粒的末端是單鏈3'末端，形成一種緊湊的T環(huán)結(jié)構(gòu)，可保持其穩(wěn)定性。其表面覆蓋著Shelterin復(fù)合物，包括TRF1（端粒重復(fù)結(jié)合因子1）、TRF2（端粒重復(fù)結(jié)合因子2）、TIN2（TRF1相互作用核的蛋白2）、RAP1（rif相關(guān)蛋白）、POT1（端粒保護(hù)）和TPP1（端粒保護(hù)蛋白1）成功將人表皮干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對(duì)比觀察不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)的差異特征，結(jié)果表明人胚胎、少兒、成人皮膚來(lái)源的表皮干細(xì)胞均有端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度依次減弱。提示誘導(dǎo)和增強(qiáng)端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)對(duì)維持表皮干細(xì)胞在體外自我更新和增殖能力可能具有重要意義。

miRNA的加尾法逆轉(zhuǎn)錄和qPCR，miRNA與mRNA不同，成熟的miRNA的長(zhǎng)度只有20nt左右，非常短，通常正向引物就足以覆蓋其全長(zhǎng)甚至有余，反向引物就無(wú)處安放了。那么如何實(shí)現(xiàn)miRNA的qPCR擴(kuò)增呢？解決方案就是在逆轉(zhuǎn)錄的時(shí)候設(shè)法增加逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度。普遍的方法有兩種，加尾法和莖環(huán)法。經(jīng)過(guò)加尾法或莖環(huán)法這種特殊的逆轉(zhuǎn)錄形式處理之后，得到的cDNA長(zhǎng)度從原始的20nt增加到80nt以上，這樣就能夠?qū)崿F(xiàn)miRNA的qPCR擴(kuò)增了。RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：選擇合適的引物：但其對(duì)RNA的完整度和二級(jí)結(jié)構(gòu)的要求較高，而且不適用于原核生物。隨機(jī)引物可以根據(jù)堿基情況結(jié)合到幾乎所有的RNA上，包括mRNA、tRNA和rRNA。逆轉(zhuǎn)錄是2代測(cè)序、單細(xì)胞測(cè)序等技術(shù)的前置步驟。

逆轉(zhuǎn)錄PCR的用途普遍，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、檢測(cè)細(xì)胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探針、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在臨床上RT-PCR可以用于遺傳病診斷、病癥檢測(cè)、檢測(cè)病人標(biāo)本中的RNA病毒，如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究環(huán)境脅迫對(duì)植物基因表達(dá)的影響，以及在特定的環(huán)境或生長(zhǎng)階段中植物體不同部位基因表達(dá)的差異性。使用RT-PCR檢測(cè)分析RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：理論上可以檢測(cè)幾乎任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；可以實(shí)現(xiàn)極為微量RNA樣品（ng級(jí)別）的檢測(cè)；樣品耐受性好，未經(jīng)純化的粗制生物樣品也可以用于檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄也可作為RNA表達(dá)譜的分析方法。深圳莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄混合費(fèi)用

逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)機(jī)理是RNA模板上的DNA合成。成都一體化逆轉(zhuǎn)錄報(bào)價(jià)表

加尾法逆轉(zhuǎn)錄的較大特點(diǎn)在于：對(duì)于抽提純化的miRNA，進(jìn)行無(wú)差別加尾。因此，如果用戶(hù)需要對(duì)樣本中的多個(gè)miRNA進(jìn)行考察，一次逆轉(zhuǎn)錄即可完成對(duì)所有qPCR模板的制備。qPCR引物方面，miRNA以及內(nèi)參的反向引物都是通用引物R，不同的只是正向引物。因此在設(shè)計(jì)加尾法miRNA的qPCR引物時(shí)，只需設(shè)計(jì)特異性正向引物即可，正向引物的特異性直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞。總之，加尾法適合對(duì)樣本中多個(gè)miRNA的快速檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，但有非特異性的風(fēng)險(xiǎn)。由于其特殊的加PolyA機(jī)制，因此miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄是無(wú)法只通過(guò)常規(guī)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成的。成都一體化逆轉(zhuǎn)錄報(bào)價(jià)表

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