RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計原則：1.上下游引物要保守：擴增子長度需選擇一段保守片段（100-200bp）進行PCR擴增，選擇片段需跨越內(nèi)含子，因內(nèi)含子的基因組DNA序列不會被擴增，也可減少從污染的基因組DNA中擴增得到的假陽性風(fēng)險。引物選取同樣需要保守。2.引物長度和Tm值：引物設(shè)計長度為18-25bp，Tm值在50-65℃之間，引物中GC含量在40-60%。設(shè)計引物時盡量避免出現(xiàn)4個或超過4個G堿基。RT-PCR實驗陰性對照：反轉(zhuǎn)錄陰性對照應(yīng)包括在所有的RT-PCR的實驗中，用來檢測DNA是否污染（如基因組DNA或PCR產(chǎn)物）。該對照所指不加反轉(zhuǎn)錄酶，通過反轉(zhuǎn)錄過程得到cDNA在進行熒光定量PCR檢測。如檢測到擴增，則樣本中可能含有基因組DNA污染。質(zhì)粒RNA檢測中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要特定反應(yīng)體系。武漢莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄酶試劑研發(fā)

逆轉(zhuǎn)錄是指以RNA為模板合成DNA的過程，即將遺傳信息由RNA逆向傳給DNA的過程，其遺傳的傳遞方向與轉(zhuǎn)錄相反。反轉(zhuǎn)錄酶也可寫成逆轉(zhuǎn)錄酶又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。帶gDNA Remover反轉(zhuǎn)錄測序逆轉(zhuǎn)錄可用于新型病毒的檢測。

反轉(zhuǎn)錄酶的用處：由它催化轉(zhuǎn)錄合成的DNA稱為互補DNA(cDNA)。通常情況下，細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄應(yīng)由DNA到RNA的，所得RNA為信使RNA（mRNA）供蛋白質(zhì)合成作模板用。而在部分RNA病毒中，要實現(xiàn)自身擴增，必須具有DNA，因此先由RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA再由cDNA轉(zhuǎn)錄出RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶可用RT—PCR，將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA后擴增，以獲得RNA的序列。1970年從致死RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶，并認為此酶與病毒的致死性質(zhì)有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶也分布于某些正常細胞和胚胎細胞。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)表明不能把生物的遺傳信息由DNA→mRNA→蛋白質(zhì)非常化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。它促進了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究，已成為研究這些學(xué)科的有力工具。

逆轉(zhuǎn)錄酶實驗流程：從細胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs的反應(yīng)體系中→退火，引物與RNA鏈配對→延伸，逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補cDNA鏈變性→常規(guī)PCR反應(yīng)流程（變性、退火、延伸，如此多次循環(huán)）。RT-PCR“兩步法”與“一步法”RT-PCR的實驗操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需構(gòu)建cDNA文庫（即cDNA合成與PCR反應(yīng)在同一Buffer及酶中進行，一步法完成），省略了cDNA與PCR之間的過程。兩步法RT-PCR首先用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR，即RNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增分兩步進行。逆轉(zhuǎn)錄PCR在檢測病毒、診斷疾病等方面有普遍應(yīng)用。

逆轉(zhuǎn)錄是一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，它在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。逆轉(zhuǎn)錄是指將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA的過程，與正常的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的過程相反。這個過程由逆轉(zhuǎn)錄酶來完成，而逆轉(zhuǎn)錄酶是一種酶類蛋白質(zhì)，普遍存在于病毒和一些細胞中。逆轉(zhuǎn)錄的重要性在于它是某些病毒的復(fù)制過程中必不可少的一步。許多病毒的遺傳物質(zhì)是RNA分子，而它們必須先將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA，才能利用細胞的合成機制來進行復(fù)制。這種轉(zhuǎn)錄過程一旦完成，病毒的DNA就可以與宿主細胞的DNA結(jié)合在一起，從而使病毒的遺傳物質(zhì)被復(fù)制并傳遞下去。逆轉(zhuǎn)錄實驗過程需適當(dāng)?shù)腞NA質(zhì)量，過少或質(zhì)量不佳將影響擴增效果。上海帶gDNA Remover逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄實驗時要記錄反應(yīng)體系的溫度、時間、反應(yīng)試劑的添加量等參數(shù)。武漢莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄酶試劑研發(fā)

逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。此過程中，核酸合成與轉(zhuǎn)錄（DNA到RNA）過程與遺傳信息的流動方向（RNA到DNA）相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄與反轉(zhuǎn)錄嚴格意義上來說沒有什么區(qū)別，但是逆轉(zhuǎn)錄是某些病毒的自主行為，如逆轉(zhuǎn)錄病毒，它們在整合到宿主細胞內(nèi)前以RNA為模板形成DNA的過程；反轉(zhuǎn)錄是進行基因工程過程中，人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之為模板人工合成DNA的過程。二者雖同為RNA→DNA的過程，但地點不同，相對性的來說，逆轉(zhuǎn)錄在體內(nèi)，反轉(zhuǎn)錄在體外。武漢莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄酶試劑研發(fā)

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