逆轉錄酶實驗流程：從細胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆轉錄酶、引物、dNTPs的反應體系中→退火，引物與RNA鏈配對→延伸，逆轉錄酶合成互補cDNA鏈變性→常規PCR反應流程（變性、退火、延伸，如此多次循環）。RT-PCR“兩步法”與“一步法”RT-PCR的實驗操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需構建cDNA文庫（即cDNA合成與PCR反應在同一Buffer及酶中進行，一步法完成），省略了cDNA與PCR之間的過程。兩步法RT-PCR首先用反轉錄酶合成cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR，即RNA反轉錄與PCR擴增分兩步進行。逆轉錄引物的設計需要考慮反向引物的特性。上海快速逆轉錄試劑純度高

逆轉錄實驗的準備工作：1、實驗器具與材料：（1）移液頭：200ul、10ul；（2）吸頭：200ul、20ul；（3）EP管1。5ml、100ul；（4）水浴箱。2、實驗器具的處理與準備，塑料制品：（包括吸頭、EP管等）將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小頭頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將頭頭放入吸頭臺。3、試劑配制和準備：（1）DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。逆轉錄中所用的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓，后分裝到幾個1。5mlEP管中，-20℃中保存備用。（2）RT中所需要的各種試劑。上海快速逆轉錄試劑純度高逆轉錄實驗前應對所有器具和實驗臺面消毒和清潔，避免交叉污染影響實驗結果。

逆轉錄酶的質量控制：1.切口酶：在與200單位酶37oC保溫60分鐘后，超螺旋質粒保留在90%以上。2.DNase測定：200單位酶與50ng3H-DNA37oC保溫60分鐘，分解出的放射性低于1%。3.RNase測定：200單位酶與50ng3H-RNA37oC保溫60分鐘，分解出的放射性低于3%。4.首先鏈cDNA的反應：在標準化的反應中，200單位酶催化從1mg1.2kbRNA或1mg7.5kbRNA將同位素摻入到cDNA中，通過放射自顯影，對于1.2kb的RNA，產物cDNA是單一的、全長的條帶。對于7.5kb的RNA產物有部分是全長的條帶。用這二種RNA放射性轉換到cDNA中有12%。5.RNaseH活性：200單位酶與polyA:polydT37oC保溫60分鐘，釋放出的放射性要低于1%。

大多數逆轉錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為賴氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指導的DNA聚合酶活性；以反轉錄合成的首先條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。逆轉錄實驗相關關器材如逆轉錄儀需經常檢查，以保證反應可靠性。

逆轉錄的端粒復制：對于線性基因組，其滯后鏈的末端是無法完整復制的，每次約損失30-200個核苷酸（Cells.2020Feb22;9(2).）。這樣隨著細胞分裂，端粒會持續縮短，造成復制性衰老。對于大多數體細胞來說，端粒磨損是一種控制其分裂潛力的機制，但對于需要多次增殖的干細胞來說，必須設法維持端粒長度。端粒酶（telomerase）可以通過逆轉錄過程延長端粒。端粒酶由端粒酶RNA（TERC）和端粒酶逆轉錄酶（TERT）組成。TERT使用TERC作為模板，在染色體的單鏈末端合成端粒DNA的重復序列。大多數體細胞缺乏端粒酶活性，因而容易衰老。但未分化的生殖細胞，干細胞，活化的淋巴細胞和大多數疙瘩細胞具有高水平的端粒酶活性，可以克服端粒磨損并維持無限的細胞分裂。逆轉錄反應首先需要逆轉錄酶的反應活性。上海快速逆轉錄試劑純度高

逆轉錄酶通常具有多種活性，如逆轉錄活性、復制活性與RNA酶H活性。上海快速逆轉錄試劑純度高

miRNA逆轉錄莖環法：首先需要進行RNA樣品制備，可選的方法有：離心柱法抽提（不必去除gDNA）；傳統Trizol法抽提（需要去除gDNA）。miRNA正向引物：需要分別設計。是否采用通用引物視情況而定，正向引物與通用反向引物不會形成二聚體時才能用。取200ul的PCR管，根據所得每組RNA的濃度C，每孔加入1000ng總RNA，按公式1000ng/C計算出所需RNA的體積x。然后按建議的20μL反應體系說明，依次向200μL的PCR管內加入下列試劑：加樣結束后，移液器吹打混勻，低速離心數秒。將逆轉錄PCR管放入PCR擴增儀內，調整參數：37℃15min（反轉錄反應），85℃5s（反轉錄酶的失活反應），4℃∞。反應結束后根據實驗需要進行熒光定量PCR或放入-20℃冰箱保存。說明：此處可以選擇U6下游引物作為U6的逆轉錄引物，注意相應地調整無酶水的體積和反應溫度。上海快速逆轉錄試劑純度高

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