RNA提取和DNA提取實驗中常見問題及過程中的注意事項:降解:降解問題是RNA制備中常常到的問題。因為在RNA提取過程中,樣品儲存不當或裂解效率低等情況都會導致降解。對于DNA提取,降解不是一個大問題,因為對于PCR,DNA可以被剪切并且工作正常,如果不希望有較多剪切的DNA,可以使用弱裂解的方法。PCR清理時的注意事項:PCR凈化其實并不是DNA提取技術本身,但它是一種效率高且簡單的技術,它只是添加高濃度的結合鹽(通常每體積PCR反應3-5體積鹽)和離心來過濾。在實驗過程中,PCRClean-up試劑盒出現故障也會導致整個實驗功虧一簣。因為在PCR反應中有較多吸收260度紫外線的物質,比如:核苷酸、去污劑、鹽和引物。所以,PCR凈化試劑盒經常無法正常工作可能是由于PCR反應失敗所造一般成較難清理。RNA提取需要使用合適的緩沖液和試劑來提高RNA的純度。西安核酸RNA提取
磁珠法提取DNA提取方法的工作原理:磁珠法是通過裂解液裂解細胞組織樣本,從樣本中游離出來的核酸分子被特異的吸附到磁性顆粒表面,蛋白質等雜質不被吸附而留在溶液中。將攜帶核酸的磁珠移動至不同的試劑槽內,通過反復快速攪拌、混勻液體,經過細胞裂解、核酸吸附、洗滌與洗脫等步驟,較終得到純凈的核酸。磁珠提取DNA原理:電荷的鹽離子的作用(如Na+),帶負電的磷酸基團借由解離的鹽離子(如Na+)與羧基形成離子橋,使DNA被特異性吸附到羧基磁珠表面。當PEG與鹽類被去除之后,加入水性分子,會快速充分水化DNA,解除其三者之間的離子相互作用,使得吸附到磁珠的DNA被純化出來。西安核酸RNA提取DNA提取需要使用化學試劑和設備,如離心機、研缽、酶等。
DNA提取濃縮:一.固體聚乙二醇(PEG)濃縮:用透析袋外敷PEG至合適量。二.丁醇抽提濃縮:DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇,但DNA不會。因此重復幾次可明顯減少DNA體積。三.乙醇或異丙醇沉淀:(1)需要陽離子鹽的存在,NaAc較常用,NaCl對含SDS樣品好,NH4Ac去除dNTP好。PiCl沉淀RNA好,但不能用于反轉錄前。(2)沉淀溫度與時間;0℃一4℃,12000g,10分鐘,小于100bpDNA需超速離心。四.精胺沉淀法:與DNA結合后使DNA結構凝縮沉淀,需在無鹽或低鹽溶液。
DNA提取的原則:1.保證核酸一級結構的完整性;2.核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子;3.其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到較低程度;4.其他核酸分子,如RNA,也應盡量去除。DNA提取的樣品準備:生物組織:一.較好新鮮組織,若不能馬上提取,應貯存-70℃或液氮。二.液氮冷凍敲碎研磨。三.組織勻漿法。四.液氮勻漿法。培養細胞:懸浮生長細胞:1500g離心,4℃10分種收集細胞。單層培養細胞:可用刮棒或胰酶消化后離心收集。血液樣品:血液樣品一.血液抗凝易用檸檬酸抗凝液(ACD):檸檬酸0.48g;檸檬酸鈉1.32g;右旋葡萄糖1.47g加H2O至100ml,每6ml新鮮血液加1mlACD液零度保存數天,-70度長期貯存。DNA提取的方法有很多種,包括CTAB法、鹽法、酚-氯仿法等。
RNA提取和DNA提取實驗中常見問題及過程中的注意事項:低純度:如果提取的DNA被蛋白質污染(低260/280),那么您可能開始時樣品過多,而蛋白質沒有完全去除或溶解。如果DNA的260/230比率不佳,則問題通常是結合或洗滌緩沖液中的鹽分。確保使用較高質量的乙醇來制備洗滌緩沖液,如果問題仍然存在,請再次洗滌色譜柱。與其他樣品相比,一些樣品含有更多的抑制劑。環境樣品特別容易出現純度問題,因為腐殖質在提取過程中會被溶解。腐殖質的行為與DNA相似,很難從硅膠柱中去除。DNA提取后可以用于PCR擴增、測序、基因編輯等多種應用。揚州高脂肪含量DNA提取
DNA提取的不同方法可以用于不同類型的樣品和研究目的。西安核酸RNA提取
DNA提取的幾種方法介紹,DNA提取的成功與否取決于樣品的質量和實驗技術的熟練程度。苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相.離心分層后取出水層,多次重復操作,再合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性質,用乙醇沉淀DNA.此時DNA是十分黏稠的物質,可用玻璃漫漫繞成一團,取出.此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態。西安核酸RNA提取
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