RT-PCR逆轉錄引物設計原則：1.上下游引物要保守：擴增子長度需選擇一段保守片段（100-200bp）進行PCR擴增，選擇片段需跨越內含子，因內含子的基因組DNA序列不會被擴增，也可減少從污染的基因組DNA中擴增得到的假陽性風險。引物選取同樣需要保守。2.引物長度和Tm值：引物設計長度為18-25bp，Tm值在50-65℃之間，引物中GC含量在40-60%。設計引物時盡量避免出現4個或超過4個G堿基。RT-PCR實驗陰性對照：反轉錄陰性對照應包括在所有的RT-PCR的實驗中，用來檢測DNA是否污染（如基因組DNA或PCR產物）。該對照所指不加反轉錄酶，通過反轉錄過程得到cDNA在進行熒光定量PCR檢測。如檢測到擴增，則樣本中可能含有基因組DNA污染。逆轉錄PCR在檢測病毒、診斷疾病等方面有普遍應用。南京miQP2逆轉錄混合純度高

反轉錄酶的用處：由它催化轉錄合成的DNA稱為互補DNA(cDNA)。通常情況下，細胞內的轉錄應由DNA到RNA的，所得RNA為信使RNA（mRNA）供蛋白質合成作模板用。而在部分RNA病毒中，要實現自身擴增，必須具有DNA，因此先由RNA逆轉錄合成cDNA再由cDNA轉錄出RNA。逆轉錄酶可用RT—PCR，將RNA轉變為DNA后擴增，以獲得RNA的序列。1970年從致死RNA病毒中發現了反轉錄酶，并認為此酶與病毒的致死性質有關。反轉錄酶也分布于某些正常細胞和胚胎細胞。反轉錄酶的發現表明不能把生物的遺傳信息由DNA→mRNA→蛋白質非常化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。它促進了分子生物學、生物化學和病毒學的研究，已成為研究這些學科的有力工具。長春市莖環法逆轉錄混合實時熒光PCR檢測需要經過逆轉錄反應。

逆轉錄酶實驗一步法與兩步法具有以下區別：一步法比兩步法更快速、簡便、減少了污染機會、減少了RNA二級結構、減少了PCR反應的錯配率；兩步法的優勢在于中間產物cDNA，便于保存；且第二步PCR只取逆轉錄反應產物的1/10進行反應，有利于PCR條件的調整，實驗重現性強；兩步法可以在第二步PCR反應體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法包括首先鏈cDNA合成和隨后的PCR反應，容易產生污染問題；兩步法的實驗預算要低于一步法。

逆轉錄引物：加尾法逆轉錄引物的結構并不是想象中那么簡單的oligodT，其包含三個關鍵結構：①為了與PolyA序列互補配對，OligodT序列必不可少。②在OligodT序列的5端，存在一段通用序列，用于qPCR過程中反向引物與cDNA的結合。③OligodT序列的3端存在一個或兩個錨定堿基，V或者VN。(兼并堿基，V表示A、G或C，N表示ATCG中的任意一種)。如果沒有錨定堿基，逆轉錄引物中的OligodT就會隨機結合到PolyA的任意位置，這樣會造成同一miRNA的逆轉錄產物長度不一，給較后的熔解曲線檢測帶來麻煩。因此，錨定堿基的作用就是特異性地結合到miRNA上，從而讓逆轉錄引物結合到緊挨著miRNA的那段PolyA序列上。只有這樣，才能夠保證同一miRNA的逆轉錄產物大小相同。逆轉錄實驗過程中避免光照，防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。

逆轉錄酶實驗流程：從細胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆轉錄酶、引物、dNTPs的反應體系中→退火，引物與RNA鏈配對→延伸，逆轉錄酶合成互補cDNA鏈變性→常規PCR反應流程（變性、退火、延伸，如此多次循環）。RT-PCR“兩步法”與“一步法”RT-PCR的實驗操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需構建cDNA文庫（即cDNA合成與PCR反應在同一Buffer及酶中進行，一步法完成），省略了cDNA與PCR之間的過程。兩步法RT-PCR首先用反轉錄酶合成cDNA，然后以cDNA為模板進行PCR，即RNA反轉錄與PCR擴增分兩步進行。逆轉錄過程的揭示是分子生物學研究中的重大發現，是對中心法則的重要修正和補充。南京快速逆轉錄混合企業

逆轉錄后的DNA可用于構建基因工程載體。南京miQP2逆轉錄混合純度高

miRNA的加尾法逆轉錄和qPCR，miRNA與mRNA的在qRT-PCR過程有所不同。一般來講，mRNA比較長，其長度通常在幾百至幾千個核苷酸，因此使用隨機引物(RandomPrimerp(dN)6)即可隨機結合到mRNA的各位置進行逆轉錄。由于qPCR的過程只需擴增目的片段的一部分(80~200bp)，因此使用隨機引物的逆轉錄產物盡管不完整，也完全能夠滿足qPCR的需求。當然，也可以使用OligodT引物統一從mRNA的ployA尾巴開始逆轉錄。這種逆轉錄引物在擴增cDNA全長時是必須的，但要注意，原核生物的mRNA和某些lncRNA不具有ployA尾，因此不能使用OligodT引物進行逆轉錄。南京miQP2逆轉錄混合純度高

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