O-糖基化修飾（O-GlcNAcylation）是近年來發現的一種發生在細胞內蛋白絲氨酸或者蘇氨酸殘基上的單糖修飾，其失調與腫LIU等人類疾病的發生和發展密切相關。研究表明O-糖基化修飾在結直腸AI等多種腫LIU中明顯上調，然而其促進腫LIU發生和發展的機制有待進一步的研究。

2024年10月24日，浙江大學易文和朱強共同通訊在PNAS（IF=9.4）上發表了題為“O-GlcNAcylation of enolase 1 serves as a dual regulator of aerobic glycolysis and immune evasion in colorectal cancer”的研究成果。揭示O-糖基化通過調控烯醇化酶（enolase 1, E***）來影響結直腸AI糖代謝以及免疫逃逸的機制，強調干預E***糖基化可以作為結腸AI臨床治L的潛在策略。

圖形摘要：

Highlights如下：

1）E***在腫LIU組織中的表達明顯上調；

2）E***的酶活性是CRC細胞增殖和腫LIU生長所必需的；

3）E***在蘇氨酸19（T19）上的O-糖基化增強了其酶活性；

4）抑制E***兩個位點的糖基化能聯合PD-L1單抗協同抑制結直腸腫LIU生長；

5）E***中絲氨酸249（S249）上的糖基化則抑制其與PD-L1的相互作用，并阻斷泛素連接酶STUB1介導的PD-L1泛素化以及蛋白酶體降解，促進了 PD-L1蛋白表達，進而JI活 PD-1/ PD-L1 介導的腫LIU免疫逃逸。

臨床相關性：

E***在腫LIU組織中的表達水平明顯高于正常組織。

功能研究：

E***的T19 O-糖基化促進糖酵解和結直腸腫LIU生長；S249 O-糖基化抑制抗腫LIU活性并促進結直腸腫LIU生長。

機制研究：

（1）確定E***的O-糖基化修飾2個位點T19/S249，其中T19 O-糖基化影響其活性

第一步，E***存在O-糖基化修飾

越來越多的證據表明，O-糖基化會影響幾種關鍵代謝酶的活性，從而調節細胞代謝。為了確定E***是否被O-糖基化修飾，化學酶標記實驗發現OGA（O-連接的N-乙酰葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase，OGA）是生物體內唯YI水解蛋白質O-糖基修飾的糖苷酶。）抑制劑TMG或?O-GlcNAc轉移酶（OGT）過表達的情況下，O-糖基化信號明顯升高（圖1a）。隨后用質量標記方法分析E***的O-糖基化水平，5kDa的PEG分子與疊氮標記的糖蛋白結合，導致WB信號的分子移位。通過量化移位帶和未移位帶之間的強度之比，發現正常條件下，內源性E***的修飾率約為27%（圖1b）。在不同濃度的葡萄糖、谷氨酰胺或血清時，E*** O-糖基化水平呈劑量依賴性增加（圖1c-e）。

第二步，鑒定E***上的O-糖基化位點

共表達HA-OGT和Flag-E***后，anti-Flag IP-MS質譜分析發現E***上鑒定到4個O-糖基化位點（T19、T26、S27和S249）。分別構建T19A、T26A、S27A和S249A突變體進行化學酶標記實驗，T19A和S249A突變體明顯降低了O-糖基化信號。雙位點突變（T19A/S249A）使糖基化信號減少了約80%，表明T19和S249是E***上主要的糖基化位點（圖1f-g）。此外，不同物種之間的序列比較表明，T19和S249都是進化保守的（圖1h）。

第三步，E*** T19上的O-糖基化影響其酶活

E***敲除后外源表達WT、T19A或S249A E***發現，T19A突變體，而不是S249A突變體，表現出明顯的活性降低（圖1i），使用TMG或過表達OGT處理同樣增加了WT和S249A E***的活性，但對T19A突變體沒有明顯影響（圖1i）。另外，在大腸桿菌中的共表達OGT和UDP-GlcNAc合成途徑中的關鍵酶，進一步驗證了該結果（圖1j）。表明E*** T19上的O-糖基化影響其酶活。

第四步，T19 O-糖基化促進形成E***二聚體增加E***活性

T19糖基化如何調控E***的活性？酶動力學研究發現，在OGT過表達的情況下，WT和S249A E***產生2-p-甘油的比較大速度（Vmax）都比T19A E***高得多（圖1k）。隨后研究T19糖基化是否會影響E***的低聚物化狀態。Co-IP實驗發現T19A E***破壞E***之間的結合；TMG處理則增強WT之間的互作，但沒有增強T19A E***之間的互作（圖1l）。另外，使用水溶性的交聯劑BS3（可與蛋白質上的伯胺（-NH2）反應，以穩定E***的寡聚化狀態）處理，發現O-糖基化增加了WT E***二聚體蛋白的數量，但對T19A突變體沒有明顯影響（圖1m）。表明T19 O-糖基化通過促進E***活性二聚體的形成來促進E***活性。

圖1 確定E***的O-糖基化修飾2個位點T19/S249，其中T19 O-糖基化影響其活性（Ref. Fig 2/S2）

（2）E***的S249 O-糖基化通過抑制STUB1和PD-L1的結合促進PD-L1的穩定性

據報道，E***可以通過結合PD-L1增強PD-L1與E3連接酶STUB1的關聯，從而增加細胞中PD-L1的降解。

第一步，預測分析E***和PD-L1之間的互作

基于AlphaFold2預測分析發現位于與PD-L1相互作用界面的E***的四個關鍵殘基（N52、K54、K197和E250）（圖2a-b）。

第二步，E***的E250介導與PD-L1相互作用

對每個殘基構建N52A、K54A、K197A和E250A突變體，Co-IP分析發現E250突變為丙氨酸（E250A）明顯降低了E***與PD-L1之間的相互作用（圖2c）。另外，分析還發現E***的E250能夠與PD-L1上的R125形成臨界鹽橋，從而增強相互作用的穩定性（圖2a）。表明E***的E250在介導PD-L1相互作用中的重要作用。

第三步，E***上E250附近S249糖基化影響其與PD-L1相互作用

構建全長E***及其各種截斷突變體（N端區域、DNA結合域和C端區域），GST pulldown實驗顯示只有全長的E***和E***的C端區域（包含S249糖基化位點）顯示出與PD-L1的結合信號（圖2d）。提示靠近關鍵E250殘基的S249上的大量糖基化修飾可能會破壞與PD-L1的相互作用。Co-IP分析發現，過表達WT E***明顯減少PD-L1水平；而過表達S249A E***，且無論是否存在OGT過表達，PD-L1均無明顯變化（圖2e-f）。進一步探討E*** O-糖基化對WT、T19A或S249A E***與內源性PD-L1相互作用的影響。Co-IP分析顯示，過表達WT或T19A E***后，OGT過表達增加O-糖基化水平，但降低了E***與PD-L1互作，并伴有PD-L1蛋白水平的升高，而在過表達S249A E***的細胞中沒有觀察到這種作用（圖2g-h）。類似的，TMG處理也增加了WT E***重組細胞中的PD-L1蛋白水平，但在S249A重組細胞中沒有（圖2i-j）。表明E***上E250附近S249糖基化抑制其與PD-L1互作，降低PD-L1的蛋白水平。

第四步，E*** S249 O-糖基化通過蛋白酶體降解途徑抑制PD-L1的表達

Qpcr檢測發現OGT的過表達并未改變PD-L1 mRNA水平，表明PD-L1的調控機制與轉錄無關（圖2k）。分析PD-L1的半衰期，發現TMG可促進WT E***過表達細胞中PD-L1的穩定性，但對S249A E***過表達細胞無促進作用。此外，蛋白酶體抑制劑MG132，而不是溶酶體抑制劑氯喹（CQ）或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA），挽救了S249A E***過表達細胞中PD-L1的降解（圖2l），表明E*** S249 O-糖基化通過蛋白酶體降解途徑抑制PD-L1的表達。

圖2 E***上E250附近S249糖基化影響其與PD-L1相互作用（Ref. Fig 4/S4/S5）

第五步，E***促進PD-L1與STUB1的結合

據報道，E***通過募集E3連接酶STUB1調節PD-L1的蛋白酶體降解。敲減STUB1，PD-L1表達增加（圖3a）。IP-WB實驗發現PD-L1泛素化降低，證實STUB1是CRC細胞中PD-L1的E3連接酶（圖3a）。此外，E***的缺失增加了PD-L1水平，IP-WB顯示PD-L1泛素化降低，重新表達WT E***逆轉了這種效應（圖3b-c）。相反，過表達E***可抑制PD-L1的表達，敲減STUB1，則抑制作用被消除（圖3d）。另外，內源性Co-IP實驗發現E***的缺失抑制PD-L1與STUB1互作（圖3e），而E***過表達則以劑量依賴性的方式增強PD-L1與STUB1互作（圖3f）。GST pulldown實驗也證實該結果（圖3g）。表明E***促進了PD-L1與STUB1的結合。

第六步，E***糖基化通過減少PD-L1與STUB1的結合來抑制PD-L1的蛋白酶體降解

推測E***糖基化通過減少PD-L1與STUB1的結合來抑制PD-L1的蛋白酶體降解（圖3h）。為了驗證這一點，Co-IP分析發現，在WT E***過表達細胞中，TMG處理后，降低PD-L1泛素化及其與STUB1的互作，但在S249A E***過表達細胞中沒有降低（圖3i）。此外，WB檢測顯示，過表達OGT可增強WT E***過表達細胞中PD-L1的表達，而在S249A E***過表達細胞中則無此作用。而敲減STUB1抵消這種增加（圖3j）。

表明E***糖基化阻斷了其與PD-L1的相互作用，減少了STUB1與PD-L1的相互作用，從而抑制了STUB1介導的泛素化和PD-L1的蛋白酶體降解。

圖3 E***糖基化通過減少PD-L1與STUB1的結合來抑制PD-L1的蛋白酶體降解（Ref. Fig 4/S6/S7）

結論：研究人員發現E***的表達水平在結腸AI組織中明顯上調。功能上，E***促進腫LIU生長。機制上，質譜分析和實驗驗證提示蘇氨酸19位（T19）以及絲氨酸249位(S249)是E***上主要的糖基化修飾位點。一方面，T19的糖基化通過促進活性二聚體的形成提高了其酶活性，促進腫LIU生長；另一方面，研究團隊發現S249的糖基化抑制了E***與PD-L1的互作，并阻斷了STUB1介導的PD-L1泛素化以及蛋白酶體降解，促進了 PD-L1蛋白表達，進而JI活 PD-1/ PD-L1 介導的腫LIU免疫逃逸。此外，抑制E***兩個位點的糖基化能聯合PD-L1單抗協同抑制結直腸腫LIU生長。提示E***的糖基化在結直腸AI臨床免疫治L和檢測中具有重要的意義。