Genovis的FabRICATOR Fab2 (IdeS)試劑盒可消化兔 IgG,但要在親和步驟中捕獲 Fc 片段,您需要另一種填料,而不是試劑盒中通常包含的 CaptureSelect? Fc。如果您對(duì)處理兔IgG感興趣,請(qǐng)聯(lián)系Genovis團(tuán)隊(duì),我們將在FabRICATOR Fab2試劑盒中提供與兔Fc相容的樹脂色譜柱。使用FabRICATOR的抗體消化的簡(jiǎn)單性、速度和可重復(fù)性也意味著這種酶可以被用于質(zhì)量控制應(yīng)用。 QC方法需要執(zhí)行簡(jiǎn)單,易于訓(xùn)練,高度可重復(fù),數(shù)據(jù)易于分析,這正是您使用FabRICATOR所得到的。 因?yàn)樗m用于一系列不同的IgG,這也意味著使用FabRICATOR進(jìn)行QC工作的客戶將能夠在未來的產(chǎn)品中使用它。 這顯示了這種酶在抗體消化中是多么的有效。Genovis的FabRICATOR (IdeS) 酶已成為一種接受的快速表征單克隆抗體 (mAb) 的分析工具。云南GingisKHANIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶
樣品制備的條件可能會(huì)在樣品中誘發(fā)偽影,因此需要避免高溫和堿性pH值進(jìn)行質(zhì)譜分析。如果可能的話,避免多個(gè)步驟并在一鍋反應(yīng)中進(jìn)行消化和還原也可能是有益的。與IdeS不同,為了探索Genovis的GingisREX對(duì)離液劑和去液劑的穩(wěn)定性和耐受性,在一系列試劑中測(cè)試了酶活性,并使用底物測(cè)定進(jìn)行了評(píng)估。數(shù)據(jù)顯示,GingisREX在6M時(shí)耐受尿素,吐溫高達(dá)1%,但活性在0.1%時(shí)受到SDC的負(fù)面影響。該酶在 pH 值范圍為 5.0 至 9.0 時(shí)顯示出活性,在 pH 值為 6.5-8.0 之間。綜上所述,GingisREX可用于一鍋反應(yīng),以同時(shí)消化和變性6M尿素。與Genovis的IdeS不同,雙特異性 T 細(xì)胞接合器 (BiTE) 分子是一種融合蛋白療法,其中兩個(gè) scFv 融合,形成一個(gè)雙特異性分子,其中一個(gè) scFv 靶向細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞,另一個(gè)靶向Ai癥抗原。該蛋白質(zhì)由四個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成,兩個(gè) scFv 均由 VL 和 VH 區(qū)域組成,總共由三個(gè)柔性 GS 連接子連接。這種蛋白質(zhì)的大尺寸(54 kDa)可能對(duì)通過完整質(zhì)譜法進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)構(gòu)成挑戰(zhàn),因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)MS儀器可能無法提供蛋白質(zhì)的單同位素分辨率。天津GingisKHANIdeS蛋白酶Genovis的FabDELLO作用于人 IgG1 鉸鏈上方的單個(gè)暴露賴氨酸殘基。
抗體 Fc 糖基化譜是一種重要的 CQA,因?yàn)樗鼤?huì)影響療效、和免疫原性。因此,需要從早期開發(fā)、工藝開發(fā)到質(zhì)量控制和批量放行的整個(gè)過程對(duì)Fc聚糖譜進(jìn)行監(jiān)測(cè)。傳統(tǒng)的分析方法基于對(duì)游離的聚糖進(jìn)行熒光標(biāo)記,然后通過HILIC-HPLC或CE進(jìn)行分析,這需要多步驟的樣品制備方案,這需要大量的時(shí)間和資源。使用Genovis的FabRICATOR MagIC酶解mAb,然后使用LC-MS進(jìn)行中級(jí)分析,為Fc聚糖分析提供了一種快速、直接的替代方法。如上所示,它很容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,以提高通量并降低處理錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。
與IdeS不同,Romiplostim 由四個(gè)相同的血小板生成素 (TPO) 受體結(jié)合肽和一個(gè) Fc 片段組成,通過柔性聚甘氨酸序列連接在一起。與度拉糖肽類似,用 Genovis的GlySERIAS Immobilized 在 37°C 下過夜,或用 GlySERIAS 凍干 1 小時(shí)并在 37°C 下過夜消化該蛋白質(zhì)。 鏈間二硫鍵被還原,以便于通過反相LC-MS進(jìn)行以下分析。與度拉糖肽的觀察結(jié)果類似,用固定化酶消化產(chǎn)生均質(zhì)的 Fc/2,剩下一個(gè)連接子殘基,此處為甘氨酸殘基。這有助于識(shí)別專門位于Fc區(qū)域的修改。用凍干酶消化 1 小時(shí)得到 Fc/2,剩余 4 個(gè)甘氨酸殘基和少量的 Fc/2 仍與一個(gè) TPO 肽連接。另一方面,這使得研究 Fc/2 和第yi個(gè)肽之間的連接區(qū)域成為可能,而不會(huì)受到第二個(gè)肽的干擾。用 GlySERIAS 凍干液過夜消化產(chǎn)生 2 個(gè) Fc/2 變體,分別剩下 4 個(gè)和 1 個(gè)甘氨酸殘基。根據(jù)消化時(shí)間的不同,使用凍干產(chǎn)物釋放的肽以五或七種變體存在,接頭中殘留的甘氨酸殘基數(shù)量不同,而使用固定化產(chǎn)物釋放的肽以四種變體存在。木瓜蛋白酶和 Lys-C 等傳統(tǒng)酶可用于生成 Fab 片段,但非特異性酶活性需要仔細(xì)優(yōu)化,降低多個(gè)消化位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。
與肽圖譜相比,根據(jù)Genovis科學(xué)家的經(jīng)驗(yàn),尤其是對(duì)于像抗體這樣的分子,許多人在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中做了太多的肽圖譜,而中級(jí)水平(Middle-level)的方法可以很好地工作。中級(jí)方法(IdeS酶切抗體)需要更少的實(shí)際操作步驟和較少的示例處理,所有這些都意味著過程中出錯(cuò)的事情更少。我們的許多酶可以作為平臺(tái)方法,同樣的方法適用于絕大多數(shù)的抗體,這不是肽圖的情況下,可能需要優(yōu)化整個(gè)樣品制備,LC分離,質(zhì)譜設(shè)置和數(shù)據(jù)分析的每個(gè)不同的抗體分析。這些變化可能是很小的,但沒有一種適用于所有肽圖的方法。由于分析和數(shù)據(jù)分析的簡(jiǎn)單性,中級(jí)方法非常適合自動(dòng)化和高通量的工作流程。肽圖當(dāng)然可以自動(dòng)用于樣品制備,但高通量肽圖生成大量數(shù)據(jù),仍然需要徹底分析。事實(shí)上,肽圖譜是一個(gè)多步驟的過程,每一個(gè)步驟都可能破壞方法,并可能導(dǎo)致破壞蛋白質(zhì)的人工制品,很難交叉訓(xùn)練給非專業(yè)人員。中級(jí)水平的方法很容易交叉訓(xùn)練,我們的方法在質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室中被成功地使用。肽圖譜是一種用于修飾分析和氨基酸確認(rèn)的方法,但一旦完成了這一工作,我相信使用中級(jí)分析可以成功地更有效地完成抗體樣本的大部分工作。Genovis的GingisKHAN和FabALACTICA可酶切人 IgG1,獲得完整Fab和Fc抗體片段。江西FabRICATORIdeS蛋白酶
Genovis發(fā)現(xiàn)大部分緩沖液與FabRICATOR活性兼容,已經(jīng)測(cè)試了PBS和150mM 醋酸銨 pH7,也適用于FabRICATOR HPLC。云南GingisKHANIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶
與IdeS不同。Genovis的IgASAPSub1是一種IgA1特異性酶,可在鉸鏈上方的一個(gè)特定位點(diǎn)消化人IgA1,產(chǎn)生完整且均質(zhì)的Fab和Fc片段。IgASAPSub1可水解分泌物和血清IgA1。消化在1小時(shí)內(nèi)完成,并且由于酶的特異性,如果孵育時(shí)間延長(zhǎng),則不存在過度消化的風(fēng)險(xiǎn)。該酶在pH值6.5至8.0下具有活性,不需要還原條件或輔助因子即可發(fā)揮活性。活性是在37°C下,但也可以在室溫下使用增加孵育時(shí)間進(jìn)行消化。IgASAPSub1是從口腔鏈球菌克隆而來的,并在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有His標(biāo)簽,分子量為148kDa。IgASAPSub1凍干劑以凍干粉的形式提供,裝在1000個(gè)單位的小瓶中,用于消化1mgIgA1。云南GingisKHANIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶