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海南IgGZEROIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

來源: 發(fā)布時間:2024-06-21

LC-MS中級分析是一種被大眾接受的分析方法,用于快速表征mAb和其他基于IgG的生物制藥。它有助于理解多種關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA),例如糖基化、氧化和 C 端賴氨酸剪切。這種關(guān)于翻譯后修飾(PTM)的詳細(xì)知識是生物制藥開發(fā)和制造所必需的。Genovis的FabRICATOR HPLC酶色譜柱,可快速進(jìn)行單克隆抗體的柱上酶切,并產(chǎn)生一致的亞基。該色譜柱含有固定化的FabRICATOR(IdeS)酶,可在鉸鏈下方快速且特異性地消化IgG,產(chǎn)生F(ab')2和Fc片段,而不會出現(xiàn)任何過度消化的風(fēng)險(xiǎn)。為了減少樣品處理并為樣品制備提供自動化解決方案,F(xiàn)abRICATOR被共價固定在樹脂上,并裝在適用于HPLC的PEEK色譜柱硬件中。使用FabRICATOR HPLC色譜柱,只需稍作修改,即可使用標(biāo)準(zhǔn)HPLC-MS裝置自動生成抗體亞基。然后,F(xiàn)abRICATOR HPLC色譜柱上消解產(chǎn)生的亞基被捕獲在在線連接的反相(RP)色譜柱的柱頭上。使用GlySERIAS 的連接子酶切可以通過分離連接的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域來幫助這種質(zhì)量控制。海南IgGZEROIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

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Blinatumomab(一種對 CD19 和 T 細(xì)胞標(biāo)志物 CD3 具有特異性的 BiTE 分子)的研究級生物仿制藥在室溫下用固定化過夜的 Genovis的GlySERIAS 消化。通過LC-MS對消解樣品的直接分析表明,所有三個連接子區(qū)域均被消解,α-CD3 VL和VH鏈洗脫為一個色譜峰,α-CD19 VH和VL鏈作為單獨(dú)的峰洗脫。來自連接的 α-CD3 VH 和 α-CD19 VH 結(jié)構(gòu)域的小峰顯示該短連接子未完全消化,表明 GlySERIAS 對短連接子的活性較低。與完整的蛋白質(zhì)分析相比,四個結(jié)構(gòu)域的分離提供了具有單同位素分辨率的高質(zhì)量光譜。可以觀察到每個結(jié)構(gòu)域的幾個不同變體,剩余的連接子殘基數(shù)量不同。在色譜分離過程中,α-CD3 VH結(jié)構(gòu)域無法從α-CD19 VH結(jié)構(gòu)域完全基線分離,導(dǎo)致在相關(guān)質(zhì)譜中觀察到一些共洗脫。四個結(jié)構(gòu)域的分離產(chǎn)生了有關(guān)在完整蛋白質(zhì)水平上鑒定的蛋白質(zhì)修飾位置的信息。例如,在完整水平上鑒定的 37 Da 的蛋白質(zhì)修飾被分配給 α-CD3 VH 鏈。此外,240Da 和 320da 的兩個修飾分別被分配給 α-CD3 VL 結(jié)構(gòu)域。后者還含有一個帶有五六個組氨酸殘基的 His 標(biāo)簽。這些數(shù)據(jù)證明了使用 Genovis的GlySERIAS Immobilized 對包含多個柔性連接子蛋白進(jìn)行質(zhì)量控制的中級工作流程的強(qiáng)大功能。甘肅FabRICATOR ZIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)含有富含甘氨酸的連接子的各種mAb片段進(jìn)行詳細(xì)表征的中級方法。

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與IdeS不同。Genovis的IgASAPSub1是一種IgA1特異性酶,可在鉸鏈上方的一個特定位點(diǎn)消化人IgA1,產(chǎn)生完整且均質(zhì)的Fab和Fc片段。IgASAPSub1可水解分泌物和血清IgA1。消化在1小時內(nèi)完成,并且由于酶的特異性,如果孵育時間延長,則不存在過度消化的風(fēng)險(xiǎn)。該酶在pH值6.5至8.0下具有活性,不需要還原條件或輔助因子即可發(fā)揮活性。活性是在37°C下,但也可以在室溫下使用增加孵育時間進(jìn)行消化。IgASAPSub1是從口腔鏈球菌克隆而來的,并在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有His標(biāo)簽,分子量為148kDa。IgASAPSub1凍干劑以凍干粉的形式提供,裝在1000個單位的小瓶中,用于消化1mgIgA1。

Genovis將固定化酶固定在磁珠上,用于在鉸鏈下方自動消化IgG。FabRICATOR(IdeS)是一種IgG特異性半胱氨酸蛋白酶,可消化鉸鏈下方單個氨基酸位點(diǎn)的抗體,產(chǎn)生均質(zhì)的F(ab')2和Fc片段。FabRICATORMagIC磁珠含有FabRICATOR固定化酶。這些微球能夠在中級表征工作流程中并行快速自動酶解多種抗體。它們專為自動化平臺而設(shè)計(jì),但在無法實(shí)現(xiàn)自動化的情況下,在振動臺上的表現(xiàn)同樣出色。酶切消解后,樣品可直接轉(zhuǎn)移到LC-MS的自動進(jìn)樣器進(jìn)行快速色譜分析,或轉(zhuǎn)移到其他分析方法進(jìn)行分析。自動平行抗體酶切和亞基生成允許處理與克隆選擇、工藝開發(fā)和潛在生物制藥穩(wěn)定性研究相關(guān)的大量樣品。自動抗體亞基分析可減少操作人員的時間和樣品處理錯誤的風(fēng)險(xiǎn),并提高通量。這包括FabRICATOR固定化柱和CaptureSelect Fc純化柱,用于亞基的親和純化。

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用于IgA1和IgA2m1以上鉸鏈消化的凍干酶。與IdeS不同,Genovis提供的IgASAPSub1+2在鉸鏈上方的一個特定位點(diǎn)消化人IgA1和IgA2m1,產(chǎn)生完整且均勻的Fab和Fc片段。由于人IgA1的鉸鏈比IgA2的鉸鏈長,因此IgA1和IgA2m1之間來自消化位點(diǎn)的氨基酸C末端不同。IgASAPSub1+2可消化分泌物和血清IgA。孵育時間為過夜(16-18小時),并且由于酶的特異性,沒有過度消化的風(fēng)險(xiǎn)。該酶在pH值為6.0至8.0時具有活性,不需要還原條件或輔助因子即可產(chǎn)生活性。活性為37°C。IgASAPSub1+2是從丹毒梭菌克隆而來的,并在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有His標(biāo)簽,分子量為131kDa。IgASAPSub1+2凍干劑以凍干粉的形式提供,裝在1000個單位的小瓶中,用于消化1mgIgA1和IgA2m1。IgASAP酶是降低zhiliao性IgA候選物樣品復(fù)雜性并明顯簡化IgA分析表征的寶貴工具。廣東FabULOUSIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

FabRICATOR(IdeS)酶是生物制藥行業(yè)中普遍使用的工具。海南IgGZEROIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分,IgA在自身免疫性疾病、過敏反應(yīng)、胃腸道疾病等許多不同的健康狀況中發(fā)揮作用。在天然條件和復(fù)雜生物樣品中選擇性和特異性消化IgA的能力在臨床醫(yī)學(xué)和研究中具有重要價值。IgASAP酶是降低zhiliao性IgA候選物樣品復(fù)雜性并簡化IgA分析表征的寶貴工具。人IgA1和IgA2之間的一個顯著結(jié)構(gòu)差異是鉸鏈區(qū)域。與IgA2相比,IgA1具有更長的富含O-聚糖且更靈活的鉸鏈區(qū)域。IgASAPSub1的消化位點(diǎn)位于該擴(kuò)展區(qū)域,使酶具有IgA1特異性。IgA2亞類以三種等位基因形式存在,A2m1、A2m2和A2m3。IgASAPSub1+2在脯氨酸(P)和纈氨酸(V)之間消化IgA1和IgA2m1只有N端到鉸鏈區(qū)域,但由于A2m2和A2m3中的脯氨酸殘基被精氨酸(R)殘基取代,因此這兩種同種異體型的IgA2對消化具有抗性。海南IgGZEROIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)