Genovis的FabRICATOR MagIC自動(dòng)樣品制備可用于分析和監(jiān)測不同的CQA。mAb在生產(chǎn)或儲(chǔ)存過程中的氧化就是這樣一種CQA,可能會(huì)影響zhiliao產(chǎn)品的質(zhì)量。為了展示FabRICATOR MagIC如何解決這個(gè)問題,對6種mAb的混合物進(jìn)行強(qiáng)制降解(室溫下3個(gè)月),并通過反相LC-MS進(jìn)行分析。當(dāng)在完整水平上分析mAb時(shí),可以檢測到mAb5豐度的顯著差異,同時(shí)出現(xiàn)許多新的峰。然而,無法獲得可靠的質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用FabRICATOR MagIC,mAb5變化的來源在Fab區(qū)域內(nèi)。隨后還原為 Fc/2、LC 和 Fd' 片段,可以識別差異是由于 mAb5 Fd' 片段上的色氨酸氧化,通過形成氧代內(nèi)酯 (+14 Da) 和二氧代內(nèi)酯 (+30 Da) 以及 mAb5 LC (-18 Da) 的琥珀酰亞胺化來揭示。此外,還可檢測到mAb3輕鏈的異構(gòu)化。該示例說明了FabRICATOR MagIC在mAb中級分析中的強(qiáng)大功能,它創(chuàng)建的片段足夠小,可以精確定位特定的修飾,而無需耗時(shí)耗費(fèi)資源的肽圖分析,所有這些都以相對較少的手動(dòng)操作時(shí)間快速完成。FabRICATOR MagIC在mAb中級分析功能強(qiáng)大,可精確定位特定的修飾。湖南FabRICATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)
對于攜帶突變鉸鏈的 Fc 融合蛋白或抗體來說,F(xiàn)ab 和 Fc 片段的生成可能具有挑戰(zhàn)性。Genovis的GingisKHAN酶在鉸鏈上方一個(gè)可觸及的賴氨酸位點(diǎn)消化人IgG1,在足夠溫和的還原條件下保留鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵,從而產(chǎn)生完整的Fab和Fc片段。對于融合蛋白,消化通常在鉸鏈上方獲得,但融合伴侶的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列可能導(dǎo)致其他暴露的消化位點(diǎn)。如果去除保守的 Fc N-聚糖,F(xiàn)c 中的第二個(gè)切割位點(diǎn)也可能被GingisKHAN酶切。將精選的單克隆人 IgG1 抗體和 Fc 融合蛋白與 GingisKHAN 在 37°C 下孵育 1 小時(shí),并通過 HPLC 進(jìn)行分析。山西FabRICATOR ZIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)為Fc聚糖分析提供了一種快速、直接的、自動(dòng)化,高通量的替代方法。
一些應(yīng)用(如結(jié)合研究)具有高度靈敏度,因此在制備中需要不含殘留酶的純抗體片段。因此,Genovis的 IgG 特異性蛋白酶也以固定化酶提供,可快速輕松地生成均質(zhì) F(ab')2 和 Fc/2 片段。FabRICATOR Immobilized 含有固定化的 FabRICATOR (IdeS),用于制備來自多種 IgG 的 F(ab')2 和 Fc 片段(對于兔 IgG,請咨詢),而小鼠 IgG2a 和 IgG3 可以使用含有 FabRICATOR Z Immobilized 的 FabRICATOR Z Fab2 試劑盒進(jìn)行處理 。 為了生成和純化完整的 F(ab')2 和 Fc/2 片段,使用 FabRICATOR Fab2 試劑盒處理曲妥珠單抗,并通過 SDS-page 進(jìn)行分析。首先,在室溫下在FabRICATOR固定化離心柱上消化抗體15分鐘,然后進(jìn)行短離心步驟。在 CaptureSelect ? 離心柱上純化 F(ab')2 片段,并通過降低 pH 值,然后立即調(diào)整回中性 pH 值,一步洗脫結(jié)合的 Fc 片段。使用 FabRICATOR Fab2 試劑盒從酶切到收集片段的過程大約需要 1 小時(shí)
Genovis酶的適應(yīng)性和更高的通量和自動(dòng)化工作流程的中級方法,這是非常重要的。 隨著分析方法和儀器的改進(jìn),在表征實(shí)驗(yàn)室中有更大的能力進(jìn)行更多類型的分析,或者在工藝開發(fā)或QC實(shí)驗(yàn)室中有更先進(jìn)的分析儀器。 當(dāng)涉及到能夠支持大量樣本分析的活動(dòng)時(shí),例如克隆篩選,工藝開發(fā)和驗(yàn)證以及穩(wěn)定性研究,這是非常好的。 此外,Genovis產(chǎn)品的效率、健壯性(Robust)和易用性使它們更容易應(yīng)用于這些類型的工作,而且,也適用于受控環(huán)境中的批次放行方法。Genovis的產(chǎn)品很好地支持這種類型的工作,這也促使Genovis不斷推出新產(chǎn)品和現(xiàn)有產(chǎn)品的不同形式,以支持客戶的工作。Genovis發(fā)現(xiàn)更多的緩沖液與FabRICATOR活性兼容。
Genovis的FabRICATOR是一種半胱氨酸蛋白酶,它對許多不同的物種和IgG亞類都有活性,包括人IgG亞類1-4以及猴子、兔子、大鼠和綿羊IgG的一些亞類。FabRICATOR在鉸鏈下方的單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行消化,生成F(ab’)2和Fc/2子基,可以進(jìn)一步還原生成Fd’,輕鏈和F/2子基是必需的。FabRICATOR(IdeS)通過蛋白-蛋白相互作用與目標(biāo)抗體工作,這說明了它的高特異性。事實(shí)上,它在單個(gè)位點(diǎn)消化意味著使用FabRICATOR時(shí)沒有過度消化的風(fēng)險(xiǎn),其高特異性也意味著相同的消化方案可以作為平臺(tái)方法應(yīng)用于許多不同的抗體。FabRICATOR(IdeS)不需要還原條件來獲得良好活性,也不需要任何額外的輔助因子,它將在不同生理緩沖中發(fā)揮作用。這意味著按照下面的鉸鏈消解,您將生成F(ab’)2和Fc/2片段用于分析或其他應(yīng)用。這就是為什么Fc/2和GLP-1肽都被檢測為幾種變體。北京GlycINATORIdeS蛋白酶抗體酶切
降低樣品處理錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)提高通量。湖南FabRICATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)
為什么客戶想在他們的工作試用Genovis的FabRICATOR(IdeS)。FabRICATOR的高特異性(在鉸鏈下方有單個(gè)消化位點(diǎn))以及它對IgG種和亞類表現(xiàn)出活性的事實(shí)使其成為高效表征一系列不同分子的理想工具。FabRICATOR的另一大優(yōu)勢是速度。在大多數(shù)IgG上,您可以在短短30分鐘內(nèi)生成F(ab’)2和Fc/2片段,這一速度簡化了方法開發(fā),并允許快速有效的中層表征,使客戶能夠在不比做完整質(zhì)量實(shí)驗(yàn)長太多的時(shí)間內(nèi)獲得更多關(guān)于分子的信息。Genovis發(fā)現(xiàn)更多的緩沖液與溶液中的FabRICATOR消解相容(更多信息)。Genovis已經(jīng)測試了PBS和150mM醋酸銨,pH7,結(jié)果良好。并且應(yīng)該也適用于FabRICATORHPLC。然而,緩沖液的離子強(qiáng)度會(huì)影響抗體片段在FabRICATORHPLC(IdeS)色譜柱上的保留,并且IgG1亞基需要至少100-150mM鹽才能洗脫為單個(gè)窄峰。其他IgG亞類或融合蛋白可能需要對緩沖液組成進(jìn)行一些優(yōu)化。湖南FabRICATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)