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云南GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白組學

來源: 發布時間:2024-06-26

Genovis的半胱氨酸蛋白酶 FabALACTICA (IgdE)與IdeS酶一樣是特異性蛋白酶。在二維核磁共振波譜 (2D-NMR) 之后,可以通過 HOS 分析在精確的原子水平上評估 mAb 的關鍵質量屬性。從Genovis的FabALACTICA Immobilized獲得均相Fab和Fc片段的工作流程,是評估嵌合單克隆抗體英夫利昔單抗中HOS的理想選擇,在海報“FabALACTICA產生純和均相的mAb亞基,促進2D-NMR波譜分析”中進行了描述。來自生成的 Fab 和 Fc 片段的高質量信號和光譜分辨率導致能夠觀察 Fab 和 Fc 之間的結構變化、氧化和非氧化樣品之間的差異,并通過觀察原子分辨率來比較原研劑和生物仿制藥的 HOS。孵育時間為過夜(16-18小時),并且由于酶的特異性,沒有過度消化的風險。云南GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白組學

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不同于IdeS,Genovis的FabDELLO 是一種蛋白酶,可在鉸鏈上方的單個位點消化人 IgG1,在兩小時內產生完整的 Fab 和 Fc 片段,無需還原條件。該酶對具有突變鉸鏈區域的抗體(如 LALA 突變)具有活性,并啟用中級 LC-MS 來表征具有突變鉸鏈的抗體的關鍵質量屬性。FabDELLO 在鉸鏈上方的單個位點消化人 IgG1 (...KSCDK / THTCPPCP...),生成完整的 Fab 和 Fc 片段。FabDELLO 是一種賴氨酸特異性蛋白酶。單個消化位點是人 IgG1 的三維結構的結果,使這種賴氨酸暴露于酶中。如果去除N-聚糖,則Fc上暴露的賴氨酸處可能會出現額外的消化位點。FabDELLO在天然條件下具有活性,需要鈣離子的存在。在37°C和pH 7-8.5下獲得良好活性。FabDELLO 是從 Bdellovibrio 細菌克隆而來的,并在大腸桿菌中表達。該酶含有 His 標簽,分子量為 32 kDa。云南GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白組學IgASAP Sub1+2 特異性消化鉸鏈上方的 IgA1 和 IgA2m1,產生完整且均質的 Fab 和 Fc 片段。

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Genovis除了提供IdeS酶以外,還提供很多種特異性蛋白酶,如半胱氨酸蛋白酶 FabALACTICA (IgdE)。IgdE 在鉸鏈正上方的一個特定位點消化人 IgG1,產生完整的 Fab 和 Fc 片段的均質池。它在pH值和鹽濃度范圍內具有活性,不需要任何還原劑或輔助因子。因此,與許多其他常用的蛋白酶相比,FabALACTICA不需要任何優化來避免過度消化。這使得FabALACTICA成為一種有吸引力的酶,例如在還原和非還原條件下的LC-MS分析、抗體高階結構(HOS)的結晶和NMR研究、雙特異性或多特異性抗體的表征、單價結合研究和完整的Fc聚糖分析。

Genovis提供具有低水平內Du素的FabRICATOR(IdeS)凍干酶,用于IgG的鉸鏈以下消化。FabRICATOR(IdeS)是一種IgG特異性半胱氨酸蛋白酶,可消化鉸鏈下方單個氨基酸位點的抗體,產生均質的F(ab')2和Fc片段。FabRICATORLowEndotoxin以凍干粉的形式提供兩種不同規格:2000和5000單位,分別用于消化2mg或5mgIgG。該產品配方每瓶的內Du素含量較低,2000單位小瓶的內Du素含量為<0.04EU/瓶,5000單位小瓶的內Du素含量為<0.10EU/瓶。有效消化,內DU素水平低;適用于靈敏的體內或基于細胞的檢測。Genovis提供的IgASAP Sub1+2 在鉸鏈上方的一個特定位點消化人 IgA1 和 IgA2m1,產生完整且均勻的 Fab 和 Fc 片段。

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LC-MS中級分析是一種被大眾接受的分析方法,用于快速表征mAb和其他基于IgG的生物制藥。它有助于理解多種關鍵質量屬性 (CQA),例如糖基化、氧化和 C 端賴氨酸剪切。這種關于翻譯后修飾(PTM)的詳細知識是生物制藥開發和制造所必需的。Genovis的FabRICATOR HPLC酶色譜柱,可快速進行單克隆抗體的柱上酶切,并產生一致的亞基。該色譜柱含有固定化的FabRICATOR(IdeS)酶,可在鉸鏈下方快速且特異性地消化IgG,產生F(ab')2和Fc片段,而不會出現任何過度消化的風險。為了減少樣品處理并為樣品制備提供自動化解決方案,FabRICATOR被共價固定在樹脂上,并裝在適用于HPLC的PEEK色譜柱硬件中。使用FabRICATOR HPLC色譜柱,只需稍作修改,即可使用標準HPLC-MS裝置自動生成抗體亞基。然后,FabRICATOR HPLC色譜柱上消解產生的亞基被捕獲在在線連接的反相(RP)色譜柱的柱頭上。Genovis發現更多的緩沖液與FabRICATOR活性兼容。云南GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白組學

使用GlySERIAS固定化酶和內切糖苷酶GlycINATOR消化度拉糖肽。云南GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白組學

大多數zhiliao性抗體都攜帶人IgG1骨架,雙特異性和多特異性形式的開發正在迅速增加。此類抗體的分析需要特異性酶來表征特性,例如單價結合、二硫鍵擾亂和配對Fc糖基化。傳統方案包括使用木瓜蛋白酶和Lys-C的酶消化,這需要優化以極大限度地減少過度消化并獲得足夠的產量。Genovis的FabDELLO與IdeS酶具有不同的特異性,它在鉸鏈上方的單個位點消化人IgG1,并產生完整的Fab和Fc片段。為了證明FabDELLO的特異性活性,通過非還原SDS-PAGE消化和分析了IgG1和Fc融合蛋白的選擇。所有底物均實現了完全消化,包括具有其他困難的LALA和LFLE突變的IgG1。FabDELLO酶在底物上的精確和有效性能驗證了其在生物制藥開發中的用途。云南GingisKHANIdeS蛋白酶蛋白組學