膜片鉗實驗系統:根據不同的電生理實驗要求,可以組建不同的實驗系統,但有若干共同的基本部件,包括機械部分(防震工作臺、屏蔽罩、儀器設備架)、光學部分(顯微鏡、視頻監視器、單色光系統)、電子部件(膜片鉗放大器、刺激器、數據采集的設備、計算機系統)和微操縱器在大多數膜片鉗實驗,要求所有實驗儀器及設備均具有良好的機械穩定性,以使微電極與細胞膜之間的相對運動盡可能小。防震工作臺放置倒置顯微鏡和與之固定連接的微操縱器,其他設備置于臺外。屏蔽罩由銅絲網制成,接地以防止周圍環境的雜散電場對膜片鉗放大器的探頭電路的干擾。儀器設備架要靠近工作臺,便于測量儀器與光學儀器配接。膜片鉗使用操作流程及注意事項:電腦里面的軟件不得隨意刪改,不得在本機電腦下載別的軟件。金華藥理學電生理膜片鉗網站
膜片鉗技術基本原理與特點:膜片鉗的基本原理則是利用負反饋電子線路,將微電極所吸附的一個至幾個平方微米的細胞膜的電位固定在一定水平上,對通過通道的微小離子電流作動態或靜態觀察,從而研究其功能。膜片鉗技術實現膜電流固定的關鍵步驟是在玻璃微電極邊緣與細胞膜之間形成高阻密封,其阻抗數值可達10~100 GΩ(此密封電阻是指微電極內與細胞外液之間的電阻)。由于此阻值如此之高,故基本上可看成絕緣,其上之電流可看成零,形成高阻密封的力主要有氫健、范德華力、鹽鍵等。此密封不光電學上近乎絕緣,在機械上也是較牢固的。常州細胞生物學膜片鉗實驗技術膜片鉗使用操作流程及注意事項:凡是在本平臺使用儀器的同學必須履行實驗室相關要求。
膜片鉗實驗常見問題及解決方法:膜片鉗技術是電生理記錄的常用手段,目前在科學研究中使用越來越普遍。但在具體膜片鉗實驗操作的過程中,總會遇到各種各樣的問題,對實驗人員造成很多困擾。本次講座主要從實驗角度出發,以簡單,實用的原則,著重講解實驗中遇到的各種問題,以及解決方法。從選擇實驗樣本開始,按照一般實驗進行的順序,逐步延伸,一直到如何搭建自己個性化的膜片鉗系統,使大家對膜片鉗的基礎知識以及膜片鉗實驗中遇到的各種典型問題及解決辦法有系統的了解。
膜片鉗技術——打開細胞電生理之門:定義:膜片鉗技術被稱為研究離子通道的“金標準”,是一種基于電工學和電化學原理的分析手段,可以通過檢測細胞的電信號(電生理性質)來研究化學物質、電、機械力等刺激因素對細胞功能的影響,從而幫助揭示細胞在生命活動中的化學和生物學機制。原理:膜片鉗技術是用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個平方微米的細胞膜通過負壓吸引封接起來,由于電極與細胞膜的高阻封接,在電極籠罩下的那片膜事實上與膜的其他部分從電學上隔離,因此,此片膜內開放所產生的電流流進玻璃吸管,用一個極為敏感的電流監視器(膜片鉗放大器)測量此電流強度,就替代單一離子通道電流。膜片鉗使用操作流程及注意事項:拉制儀提前預熱(至少30min)。
膜片鉗的數據如何處理:穿孔膜片(perforated patch)是為克服常規全細胞模式的胞質滲漏問題,有學者將與離子親和的制霉菌素或二性霉素b經微電極灌流到含有類甾醇的細胞膜上,形成只允許一價離子通過的孔,用此法在膜片上做很多導電性孔道,借此對全細胞膜電流進行記錄。由于此模式的胞質滲漏極為緩慢,局部串聯阻抗較常規全細胞模式高,所以鉗制速度很慢,也稱為緩慢全細胞模式。它適合于小細胞的電壓鉗位,對于直徑大于30μm的細胞很難實現鉗位。不足之處是由于電極與細胞間交換快,細胞內環境很容易破壞,因此記錄所用的電極液應與胞漿主要成分相同,如高k+,低na+和ca2+及一定的緩沖成分和能量代謝所需的物質。膜片鉗技術用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面,使之形成10~100MΩ的高阻封接,被孤立的小膜片面積為微米數量級,因此封接范圍內細胞膜光有少數離子通道。膜片鉗技術本質上也屬于電壓鉗范疇。金華藥理學電生理膜片鉗網站
膜片鉗使用操作流程及注意事項:檢查實驗室門窗。金華藥理學電生理膜片鉗網站
膜片鉗記錄的幾種形式:細胞吸附膜片(cell-attached patch) 將兩次拉制后經加熱拋光的微管電極置于清潔的細胞膜表面上,形成高阻封接,在細胞膜表面隔離出一小片膜,既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制,高分辨測量膜電流,稱為細胞貼附膜片。由于不破壞細胞的完整性,這種方式又稱為細胞膜上的膜片記錄。此時跨膜電位由玻管固定電位和細胞電位決定。因此,為測定膜片兩側的電位,需測定細胞膜電位并從該電位減去玻管電位。從膜片的通道活動看,這種形式的膜片是極穩定的,因細胞骨架及有關代謝過程是完整的,所受的干擾小。金華藥理學電生理膜片鉗網站