常見的SCPCL-5妥爾油脂肪酸,粗妥爾油(CTO)是硫酸鹽制法制漿廠的副產品。
編碼感興趣的特定分離的多肽的多核苷酸序列將被插入表達載體中并且任選地被可操作地連接至表達控制序列上,該表達控制序列適于在希望的宿主中表達該蛋白質。可以通過核苷酸測序、限制性酶切作圖和生物活性多肽在適合的宿主內的表達來確認適當的組裝。如本領域所熟知的,為了在宿主中獲得轉染的高表達水平,可以將該可操作地連接至轉錄和翻譯表達控制序列上,這些序列在所選的表達宿主中具有功能性。重組表達載體可以用于擴增和表達編碼特異性新生抗原肽的dna。重組表達載體是可復制的dna構建體,它們具有編碼特異性新生抗原肽或生物等價類似物的合成或cdna衍生的dna片段,這些dna片段被可操作地連接至適合的轉錄或翻譯調節元件上,這些調節元件來源于哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲。
在表達中具有調節作用的一種或多種遺傳元件,例如,轉錄啟動子或增強子;被轉錄成mrna并被翻譯成蛋白質的結構或編碼序列;適當的轉錄和翻譯起始和終止序列,如下文所詳述的。這樣的調節元件可以包括用于控制轉錄的操縱子序列。可以另外摻入通常賦予在宿主中進行復制的能力的復制起點以及有助于識別轉化體的選擇。當dna區域在功能上彼此相關時,將它們可操作地連接。的dna可操作地連接至多肽的dna,如果它被表達為參與多肽的分泌的前體的話;
表達控制序列和表達載體的選擇將取決于宿主的選擇。可以使用多種多樣的表達宿主/載體組合。用于真核宿主的有用的表達載體包括例如包括來自sv牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒的表達控制序列的載體。用于細菌宿主的有用的表達載體包括已知的細菌質粒,諸如來自大腸桿菌的質粒包括pcr pbrpmb9及其衍生物,更寬的宿主范圍質粒諸如m13和絲狀單鏈dna噬菌體。用于表達多肽的合適的宿主細胞包括處于適當的啟動子的控制下的原核生物、酵母、昆蟲或高等真核細胞。
高等真核細胞包括建立的哺乳動物來源的細胞系。還可以利用無細胞翻譯系統。還有利地利用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表達重組蛋白。
可以進行哺乳動物細胞中的重組蛋白的表達,因為這樣的蛋白質通常被正確折疊,適當修飾并且具有功能性。hela以及bhk細胞系。哺乳動物表達載體可以包括非轉錄元件諸如復制起點、連接至待表達的上的合適的啟動子和增強子以及其他5’或3’側翼非轉錄序列和5’或3’非翻譯序列,諸如必要的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點以及轉錄終止序列。可以根據任何合適的方法純化由轉化宿主產生的蛋白質。離心、差別溶解度或通過用于蛋白質純化的任何其他標準技術。轉移酶等可以附接至蛋白質上,以允許通過穿過適當的親和柱而容易地純化。還可以使用諸如蛋白水解、核磁共振和x射線晶體學的技術用物理方法表征分離的蛋白質。