其實電子顯微鏡相比于光學顯微鏡的重要優勢或者存在的比較大意義,準確的來說,不在于放大倍數,而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。通俗的來說,就是進行觀察的時候,除了要將物體放大,還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開來。如果兩個相鄰微粒的圖像在光學顯微鏡下,即使放大到很大,看到的可能卻是兩個相交的亮斑(艾里斑),而沒有明顯的界限(更不用說細節了),這表示是分辨率不夠。拋開分辨率談放大倍數是沒有意義的。光學顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,約等于光波波長的一半,通常被說成是光學顯微鏡放大極限,其實準確地來說,應該叫做分辨率的極限。而其產生的原因是光的衍射,根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實驗證明了電子的波動性,于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能。電子顯微鏡也有多種,題主說的是像REM的。電鏡也存在用衍射規則觀察的,比如低能電子衍射(LEED)和透射電鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體,根據其周期性的特點而生成倒易空間里的衍射圖像,借助elward球或者傅里葉變換就可以轉換到實空間,得到真正的晶體表面圖像了。雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。國內熒光激光雙光子顯微鏡授權商
雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進行亞細胞分辨率的成像,從而測量不透明腦深部的活動。成像膜的電壓變化可以直接反映神經元的活動,但神經元活動的速度對于常規的2PM來說太快了。目前,電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現,但其空間分辨率較差,且只能在淺深度成像。因此,為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化,需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列。然后,該模塊被集成到一個帶有高速數據采集系統的標準雙光子熒光顯微鏡中,如圖2所示。光源是重復頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產生80個脈沖焦點,脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像。虛光源越遠,物鏡處的光束尺寸越大,焦點越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡,從而在X軸上產生0.82m和0.35m的橫向分辨率。進口雙光子顯微鏡價位成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調焦設備。
從雙光子的原理和特點,我們可以清楚地得出雙光子的優點:☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發光源,因此該波段的光對細胞和組織的光損傷很小,適合長期研究;☆穿透能力強:與紫外光相比,可見光和近紅外光的穿透能力更強,因此受生物組織散射的影響更小,解決了生物組織深層物質的層析成像問題;☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小,只能在焦平面很小的區域激發熒光,雙光子吸收被限制在焦點處體積約為波長三次方的范圍內;☆漂白區域小:由于激發只存在于交點處,焦點外的區域不會發生光漂白;☆熒光收集率高:與共焦成像相比,雙光子成像不需要濾光片(共焦),提高了熒光收集率,直接導致圖像對比度的提高;☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長,瑞利散射產生的背景噪聲*為單光子激發產生的1/16,減少了散射的干擾;光子躍遷具有很強的選擇性激發,因此可以用來對生物組織中的一些特殊物質進行成像;
在傳統寬場顯微鏡中,來自標本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面(感光元件)上,所以其成像是整個樣品的重疊像,沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用針空有效濾除了雜散光,分辨率有了本質上的提高,擁有了對樣品的特定焦平面精細成像的能力,可以進行三維成像、動態成像等。然而,針空在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,只有很弱的熒光到達檢測器。若要提高信號強度,需要加大激發光功率,這又會導致對活細胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡蕞大的優勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應,與單光子共聚焦顯微鏡蕞大的不同在于無須使用針空限制光學散射,其具體優勢如下所述。雙光子顯微鏡在多個領域研究中已有許多成功實例。
通過對顯微光學系統的重新設計,將FHIRM-TPM2.0的成像視場擴展至420×420平方微米,顯微物鏡的工作距離擴展至1mm,實現無創成像。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊,實現深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實時成像。該模塊由一個快速電動變焦鏡頭和一對中繼鏡頭組成,在不同深度成像時保持放大率恒定。其中,變焦模塊重1.8克,科研人員可以根據實驗要求自由拆卸。此外,新型微型成像探頭可以瞬間插拔,極大簡化了實驗操作,避免了長時間實驗對動物的干擾。反復裝卸探針追蹤同批神經元時,視場旋轉角度小于0.07弧度,邊界偏差小于35微米。對于顯微成像技術包含:寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。進口2PPLUS雙光子顯微鏡廠家電話
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1990年初,當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業準備前往瑞士讀博后時,他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書,從中了解到非線性光學效應——強光和物質的相互作用。當時,Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件,于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,換言之,與其通過一個紫外光子激發標記的鈣離子,通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器,Denk聯合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建,采集數據則用了兩到三天,于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。國內熒光激光雙光子顯微鏡授權商