去泛素化酶USP8靶向鐵死亡提高腫瘤免疫治L的機制

來源：發布時間：2024-12-18

鐵死亡是一種由大量脂質過氧化物積累所驅動的調節性細胞死亡方式，與腫LIU發病密切相關，其調控機制尚不清楚。因此，深入理解腫LIU細胞抵抗鐵死亡的分子機制，將為腫LIU治L 提供新策略。

2024年4月，武漢大學醫學研究院、教育部免疫與代謝前沿科學中心、中南醫院以及泰康生命醫學中心團隊在PNAS雜志上，發表“USP8-governed GPX4 homeostasis orchestrates ferroptosis and cancer immunotherapy”的研究成果。該研究揭示了USP8通過穩定谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）來抵抗鐵死亡，并強調了靶向USP8作為一種潛在的治L 策略來促進鐵死亡，以增強AI癥免疫治L 。

圖形摘要：

Highlights如下：

1）USP8的特異性敲除導致小鼠過早死亡，并伴有結腸上皮結構紊亂和脂質過氧化跡象。

2）抑制USP8可以增加腫LIU細胞對鐵死亡的敏感性。改善PD-1/PD-L1阻斷抗體的治L 效果。

3）機制上，USP8與GPX4相互作用，并去除GPX4的多聚泛素化修飾，從而抑制蛋白酶體介導的GPX4蛋白降解，抑制鐵死亡，促進腫LIU進展。

表型相關性：

Usp8的特異性敲除導致小鼠壽命縮短，腸上皮細胞死亡增加和脂質過氧化跡象增多。

功能研究：

體外抑制USP8增加腫LIU細胞對鐵死亡的敏感性。USP8抑制劑聯合鐵死亡誘導劑能明顯抑制腫LIU生長并改善PD-1/PD-L1阻斷抗體的治L 效果。

機制研究：

前面的研究顯示USP8能抑制鐵死亡。為了進一步探索USP8介導鐵死亡調控的分子機制，檢測USP8是否可以調節鐵死亡通路中關鍵蛋白的表達。

（1）初步確定下游的蛋白分子

通過WB檢測鐵死亡相關蛋白，發現敲低明顯降低GPX4蛋白的表達（圖1a-b）,但不影響其RNA水平（圖1c）。同樣抑制劑亦能降低GPX4的蛋白水平（圖1d）。構建GPX4 WT及其酶促失活突變體U46S進行功能實驗，證實過表達GPX4 WT蛋白在抑制RSL3誘導的鐵死亡方面具有功能（圖1e）。放線菌酮(CHX)試驗表明，敲低USP8縮短GPX4蛋白的半衰期（圖1f）。表明USP8可能作為一種去泛素化酶在翻譯后水平調節GPX4的蛋白豐度。蛋白酶體介導的降解系統和自噬-溶酶體系統是調控蛋白質穩態的兩大系統。而實驗表明蛋白酶體抑制劑MG132挽救了敲減USP8介導的GPX4不穩定，而溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1 (BafA1)和氯喹(CQ)則無此作用（圖1g），表明USP8介導的GPX4穩態調節取決于蛋白酶體系統。

圖1 USP8影響GPX4蛋白的穩定性（Ref. Fig 4）

（2）分子互作機制

第一步，確定與下游蛋白分子的互作關系

為了探索USP8與GPX4是否互作，進行內源Co-IP實驗和GST pulldown實驗，發現USP8與GPX4互作（圖2a-c）。

第二步，USP8與GPX4蛋白結合的具體的位置

為了探索USP8與GPX4蛋白結合的位置，針對USP8構建不同的突變體分別進行Co-IP實驗，發現USP8通過 aa1-313、aa715-1118區域與GPX4結合（圖2d-e）。

第三步，USP8如何影響GPX4蛋白的穩定性

USP8是一個去泛素化酶。Co-IP分析發現，USP8能降低GPX4的泛素化水平，而酶非活性突變體USP8-c786a則不能去除GPX4的泛素鏈，表明USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（圖2f）。

圖2 USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（Ref. Fig 4/S4）

第四步，確定USP8去除GPX4的Ub K48鏈泛素化

眾所周知，泛素分子可以通過其七個賴氨酸(K)殘基中的一個(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)連接形成不同的泛素鏈?；诖?，Co-IP分析發現GPX4被K27和K48連接的泛素化修飾（圖3a）。另外，Co-IP分析顯示USP8過表達降低GPX4上K48連接的泛素化，而不影響K27連接的泛素化（圖3b），表明USP8主要去除GPX4上K48連接的泛素化。體外去泛素化試驗表明（注：Ub(K48O)(只有完整的Lys48殘基的Ub)），USP8過表達以去泛素酶活性依賴性方式去除GPX4上K48連接的泛素化（圖3c）。

第五步，確定USP8去除GPX4蛋白泛素化位點

之前的研究已報道K48、K125、K127、K135和K151是GPX4的潛在泛素化位點。構建不同的泛素化位點突變體進行Co-IP分析，發現GPX4 K48R、K125R、K127R和K151R突變體K48連接的泛素化減少（圖3d）。另外，USP8過表達降低GPX4 WT、K125R、K127R和K151R突變體的泛素化，但未能消除GPX4 K48R突變體的泛素化（圖3e）。表明USP8主要去除GPX4上K48殘基的泛素化。

綜上所述，這些結果表明USP8作為穩定GPX4的關鍵上游調節因子，主要通過去除GPX4上K48連接的泛素化來防止其蛋白酶體介導的降解。

圖3 USP8去除GPX4上K48殘基的K48鏈泛素化（Ref. Fig4/S4）

結論：本研究在小鼠腸上皮細胞特異性敲除Usp8后，觀察到結腸結構改變，小鼠壽命縮短，伴隨著腸上皮細胞死亡增加和脂質過氧化跡象增多。功能上，Usp8雜合缺失小鼠可抑制結直腸腫LIU發生和發展，體外抑制USP8可以增加腫LIU細胞對鐵死亡的敏感性。機制上，USP8與GPX4發生相互作用，并去除GPX4的多聚泛素化修飾，從而抑制蛋白酶體介導的GPX4蛋白降解。此外，USP8抑制劑聯合鐵死亡誘導劑能夠改善PD-1/PD-L1阻斷抗體的治L 效果。這項研究揭示了USP8通過調節GPX4的穩態從而在體內調控鐵死亡的機制，為AI癥治L 提供了新的治L 靶點。