羅丹明123一種可對活細胞線粒體染色的細胞染色試劑。羅丹明123可透過細胞膜且在活細胞的線粒體內(nèi)聚集，并發(fā)出黃綠色熒光。羅丹明123***用作檢測線粒體膜電位，也常用于細胞凋亡檢測。由于細胞內(nèi)ATP的量與羅丹明123的熒光強度之間有相關(guān)性，此熒光染料被應(yīng)用于檢測細胞內(nèi)的ATP。羅丹明123的比較大激發(fā)波長為507nm，比較大發(fā)射波長為525nm。在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光。

一：工作液配制用緩沖液或者預(yù)熱的培養(yǎng)液直接稀釋儲存液到需要的工作液濃度（1～20μM），充分混勻。具體的工作液濃度使用者要根據(jù)自身實驗體系進行調(diào)整。【注意】：對于細胞實驗，要控制好總體稀釋倍數(shù)，DMSO在培養(yǎng)液中的濃度不能超過0.1%，以避免DMSO對細胞的影響。

二：熒光顯微鏡觀察1、用載玻片準備細胞。細胞數(shù)目應(yīng)為5×104～5×105個/mL。2、在載玻片上孵育細胞，用PBS或HBSS洗滌細胞。3、將Rhodamine123工作液加入載玻片并在37℃下孵育30min至1小時。4、去除Rhodamine123溶液并用培養(yǎng)液洗滌細胞（洗滌細胞后如果要固定，加入10%福爾馬林緩沖液并孵育15～20min，接著用PBS洗滌）。5、熒光顯微鏡觀察細胞。 FITC熒光染料標記方法。化合物熒光染料Cy3

D-熒光素是熒光素酶 (Luc) 的天然底物，可催化螢火蟲產(chǎn)生典型的黃綠色光。該反應(yīng)的 560 nm 化學發(fā)光在幾秒鐘內(nèi)達到峰值，當?shù)孜餆晒馑剡^量時，光輸出與熒光素酶濃度成正比。熒光素酶 (luc) 基因是用于研究和藥物篩選的流行報告基因。化學發(fā)光技術(shù)幾乎沒有背景，使得 luc 報告基因成為檢測低水平基因表達的理想選擇。標準閃爍計數(shù)器可以可靠地測量低至 0.02 pg 的熒光素酶。除了作為基因表達報告者的作用外，熒光素酶還常用于極其靈敏的 ATP 檢測中[1]。我們提供螢火蟲熒光素酶 (HY-P1004)、熒光素游離酸 (HY-12591A) 及其水溶性鈉鹽 (HY-12591) 和鉀鹽 (HY-12591B)。細胞熒光染料發(fā)射生物發(fā)光是利用熒光素酶報告基因在體內(nèi)表達產(chǎn)生的熒光蛋白與體外注射的熒光素底物發(fā)生化學反映產(chǎn)生熒光。

選擇熒光染料時要考慮那些因素：激發(fā)波長處的消光系數(shù)應(yīng)盡可能高：消光系數(shù)是衡量可以吸收多少光子的量度。量子產(chǎn)率應(yīng)該盡可能高：這是吸收光子與發(fā)射光子的比率。消光系數(shù)和量子產(chǎn)率的乘積就是亮度。熒光染料應(yīng)該是光穩(wěn)定的：遺憾的是，比較不同公司染料的光穩(wěn)定性的研究并不多。光致變色行為：對于STORM實驗，您需要一個閃爍的熒光團。但是，對于分子跟蹤實驗，您***不想要閃爍的熒光團。活/死細胞滲透性。您想要的反應(yīng)側(cè)基（例如HaloTag、抗體等）。當您使用多個熒光探針時，尤其是當您量化共定位時，請謹慎處理其他顏色通道中的滲色。單獨測試所有熒光探針以評估滲透。

染料DiI, DiO, DiD 和 DiR是一類親脂性熒光染料家族，用于標記細胞膜和疏水性組織。這是一類環(huán)境敏感型熒光染料，當它們與膜結(jié)合或者與親脂性生物分子(例如蛋白質(zhì)，雖然在水中其熒光強度很弱)結(jié)合時，其熒光強度***增強。它們具有很高的淬滅系數(shù)，偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命。一旦應(yīng)用于細胞中，這種染料會在細胞內(nèi)質(zhì)膜中逐步擴散，導致在其比較好濃度條件下，將整個細胞染色。它們不同的熒光顏色：DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光），為活細胞多色彩熒光成像分析和流式細胞術(shù)提供了一種便捷的工具。DiO和DiI可以分別與標準的FITC和TRITC濾光器一同使用。其中，DiO可以被633 nm He-Ne激光激發(fā)，并且具有比DiI更長的激發(fā)和發(fā)射光波長，為標記細胞和組織的那些本身就具有本底熒光的染料提供了非常***的替代品。DiR在***成像或者示蹤中非常有用，因為它們所發(fā)射的紅外光可以高效地穿過細胞和組織，并且在紅外光范圍內(nèi)，其本底熒光水平很低。熒光染料可以單獨使用，也可以組合成復合熒光染料使用。

細胞培養(yǎng)后，需要對其生長情況、形態(tài)甚至生物學性狀進行觀察。由于細胞小而復雜，若不借助適當?shù)氖侄危y以觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)，更難發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細胞的技術(shù)，從光學顯微鏡到電子顯微鏡，從一般細胞化學法到免疫化學法。細胞染色是研究細胞生物學特征的一種常用手段，然而，對于細胞實驗新手來說，想要獲得一張漂亮的細胞染色圖并不容易。染色試劑不會選、細胞染色不均勻、染色時切片脫落等都是很常見的問題。

細胞膜常用染料DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常見的細胞膜染料（見表2），它們是一族親脂性的熒光染料，用于細胞的形態(tài)學和結(jié)構(gòu)研究。該系列染料進入細胞膜后，會在整個細胞膜上側(cè)向擴散，在比較好濃度時可以使整個細胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高，染色均一，熒光不易猝滅，無明顯細胞毒性，且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應(yīng)用于多種細胞的體內(nèi)示蹤研究，如Treg細胞、間充質(zhì)干細胞、腫瘤細胞、造血干祖細胞等。 Cy5.5含有一個游離胺基,可與多種官能團共軛,包括NHS酯和環(huán)氧化合物。流式細胞熒光染料熒光素鉀鹽

Cy7 DiC18（DiR）是一個親脂性、近紅外熒光花青染料，這個染料常用于標記細胞質(zhì)膜。化合物熒光染料Cy3

小動物***成像技術(shù)（invivoimagingtechnology）是利用高靈敏度的光學檢測儀器直接檢測動物***體內(nèi)的細胞活動和基因行為研究的一類技術(shù)，是近年來發(fā)展**快的生命科學研究方法，是**直接觀察細胞和分子在體內(nèi)行為的新興技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于生命科學研究的各個領(lǐng)域[1]。***動物體內(nèi)光學成像主要采用生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是利用熒光素酶報告基因在***內(nèi)表達產(chǎn)生的熒光蛋白與體外注射的熒光素底物發(fā)生化學反映產(chǎn)生熒光。而熒光發(fā)光成像技術(shù)是將熒光物質(zhì)或熒光物質(zhì)標記的小分子物質(zhì)如基因、細胞也可是小分子藥物、抗體、納米材料等導入到***體內(nèi)，通過小動物***成像系統(tǒng)的激發(fā)光源激發(fā)熒光集團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生波長較激發(fā)光長的發(fā)射光，然后通過高靈敏度制冷CCD鏡頭探測到***內(nèi)的發(fā)射光。通過***成像技術(shù)可以觀測***動物體內(nèi)**的生長和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達和藥物作用效果等生物學過程。化合物熒光染料Cy3

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