SuperFluor活化酯(與Invitrogen的AlexaFluor活化酯完全相同)SuperFlour系列熒光探針,具有更強的熒光強度,更廣的pH應用范圍(pH4~10),更好的抗淬滅性。在生物熒光領域已逐漸替代FITC,Cy3,Cy5,Cy5.5,Cy7等熒光染料。1.標記效率低——計算結果顯示每摩爾145,000MW的蛋白標記的熒光團少于4mol有以下原因:1)緩沖液中含有痕量伯銨成分,與染料反應降低了標記效率。如果蛋白已經溶于含氨基的緩沖液(如Tris或氨基乙酸),標記前用PBS透析。2)蛋白含量較低(≤1mg/mL)會影響標記效率。3)標記步驟中加入碳酸氫鈉的作用是將反應混合物的pH升高至~8,因為在弱堿性環(huán)境中標記反應的效率比較高。如果蛋白溶液的緩沖范圍在低pH,加入重碳酸鹽也無法將pH調節(jié)至**適水平。要么加大重碳酸鹽的量,要么將緩沖液換成PBS,或用0.1M碳酸氫鈉透析等。4)研究顯示pH升至9.0~9.4,標記效率和標記速度(只需10min)明顯改善。5)不同抗體與熒光團的反應速率不同,染料標記后保留的生物活性程度也不同,因此標準步驟也不是總有比較好的標記結果。為增加標記率,可以對同一樣品進行再標記,或減少蛋白的量加大染料的量重新標記。有研究者在室溫孵育1小時后再4℃孵育過夜,情況有所改善。FITC熒光染料標記方法。寧夏外泌體熒光染料
三、流式細胞儀分析1、取對數生長期的細胞,接種到孔板,過夜培養(yǎng)。2、如果要進行藥物刺激,在細胞中加入感興趣的藥物進行干預,繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后,收集細胞,PBS清洗2次。3、加入Rhodamine123工作液重懸細胞,37℃避光孵育15min或更長時間。【注意】:由于細胞種類和實驗體系不同,Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據預實驗或參考文獻自行調整。4、用流式細胞儀檢測。
四、實驗案例1、取對數生長期A549細胞接于六孔板(1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基),37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁,以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液,PBS洗滌兩次.3、用培養(yǎng)基(無血清)稀釋Rh123母液制備1~20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細胞類型和細胞濃度。4、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細胞去除背景色.6、熒光顯微鏡觀察. 寧夏外泌體熒光染料吲哚菁綠的主要作用之一是在醫(yī)學影像學中作為造影劑。
管可用于實驗室的熒光團數量眾多,但這些染料通常屬于以下三組之一:熒光染料:這些是用于在體外標記生物相關分子的小型有機天然或合成熒光分子。該組中的一些熒光染料包括熒光素、溴化乙錠和花青。熒光蛋白:這些是較大的、生物制造的蛋白質,由于它們的大分子結構而發(fā)出熒光。GFP、RFP和YFP是屬于該組的一些染料。量子點:這些高熒光合成納米晶體由半導體材料制成。隨著熒光基本特性的廣泛應用和該領域的顯著進步,已經針對特定應用和儀器開發(fā)和優(yōu)化了數百種活性熒光染料。同樣,多年來,大量復雜的熒光技術(例如,FRET、TRF、FP、FRAP、FACS、FCS)也在不斷發(fā)展。
蛋白熒光標記技術是目前**為常見的蛋白體外標記技術,利用級聯(lián)放大反應原理,將極度敏感性且易于檢測的熒光素通過某個基團吸附或共價結合后,標記到特異性抗原或抗體分子上,應用熒光顯微鏡觀察熒光標記物因增強放大效應而產生顏色、光譜等變化,以分析示蹤相應抗體或抗原性質與含量的方法。該技術在具有高度精確性的熒光顯微鏡下,借助高度靈敏性的熒光檢測,在各種生物過程中對目的蛋白進行可視化,從而通過抗原抗體高度特異性免疫定量表達或在細胞研究中定位。蛋白熒光標記已成為研究蛋白質互作、酶活性、***示蹤以及細胞分選重要工具。蛋白標記常用熒光染料隨著蛋白熒光標記技術不斷發(fā)展,各類熒光素廣泛應用于生物實驗中,目前常用標記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。南京星葉生物科技有限公司提供多種性價比高的各類活化熒光素,其熒光染料覆蓋波長范圍從350nm到790nm,例如Cy系列、SuperFluor系列(效果同AlexaFluor系列)等,用于標記抗體、多肽以及蛋白功能基團,繼而生成分子探針,通過熒光成像進行相應檢測。Cy5.5含有一個游離胺基,可與多種官能團共軛,包括NHS酯和環(huán)氧化合物。
熒光染料在細胞實驗中具有廣泛的應用1、細胞膜標記:可以使用熒光染料標記細胞膜,以觀察和研究細胞膜的動態(tài)和結構變化。2、染色體和DNA標記:用熒光染料標記染色體或DNA,可以觀察和分析DNA復制、轉錄、修復等過程3、蛋白質標記:通過熒光染料標記蛋白質,可以研究蛋白質的相互作用、定位和運動等特性。4、細胞器標記:使用特定波長的熒光染料可以標記和可視化細胞中的線粒體、溶酶體等細胞器。5、神經科學應用:熒光染料在神經科學中也有廣泛應用,如標記神經元和突觸,觀察神經信號的傳遞等。6、基因表達分析:通過熒光染料標記基因表達產物,可以定量分析基因的表達水平和細胞中的分布情況。DAPI染色液(DAPI Staining Solution)常用于細胞核染色,可將細胞核染成藍色。熒光染料綠色
目前常用標記蛋白/抗體的熒光素主要有BODIPY類、香豆素類、羅丹明類、近紅外類、NBD胺類以及菁染料等。寧夏外泌體熒光染料
一:染色液制備1、配制儲液:儲液用無水DMSO或無水EtOH配制,濃度1~5mM。注:未使用的儲液建議分裝后儲存在-20℃,避免反復凍融。2、工作液制備:用合適的緩沖液(如:無血清培養(yǎng)基,HBSS或PBS)稀釋儲液,配制濃度為1~5μM的工作液。注:工作液**終濃度建議根據不同細胞系和實驗體系來優(yōu)化。建議從推薦濃度的10倍范圍內開始比較好濃度的摸索。二:懸浮細胞染色1、加入適當體積的染色工作液重懸細胞,使其密度為1×106/mL。2、37℃孵育細胞2~20min,不同的細胞比較好培養(yǎng)時間不同。可以20min作為起始孵育時間,之后優(yōu)化體系以得到均一的標記效果。3、孵育結束,1000~1500rpm離心5min。傾倒上清液,再次緩慢加入37℃預熱的生長培養(yǎng)液重懸細胞。4、重復步驟3兩次以上。寧夏外泌體熒光染料