從雙光子的原理和特點，我們可以清楚地得出雙光子的優點:☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發光源，因此該波段的光對細胞和組織的光損傷很小，適合長期研究；☆穿透能力強:與紫外光相比，可見光和近紅外光的穿透能力更強，因此受生物組織散射的影響更小，解決了生物組織深層物質的層析成像問題；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小，只能在焦平面很小的區域激發熒光，雙光子吸收被限制在焦點處體積約為波長三次方的范圍內；☆漂白區域小:由于激發只存在于交點處，焦點外的區域不會發生光漂白；☆熒光收集率高:與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片(共焦)，提高了熒光收集率，直接導致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長，瑞利散射產生的背景噪聲*為單光子激發產生的1/16，減少了散射的干擾；光子躍遷具有很強的選擇性激發，因此可以用來對生物組織中的一些特殊物質進行成像；這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡應用

通過對顯微光學系統的重新設計，將FHIRM-TPM2.0的成像視場擴展至420×420平方微米，顯微物鏡的工作距離擴展至1mm，實現無創成像。嵌入可拆卸的快速軸向掃描模塊，實現深度180微米的三維體成像和多平面快速切換的實時成像。該模塊由一個快速電動變焦鏡頭和一對中繼鏡頭組成，在不同深度成像時保持放大率恒定。其中，變焦模塊重1.8克，科研人員可以根據實驗要求自由拆卸。此外，新型微型成像探頭可以瞬間插拔，極大簡化了實驗操作，避免了長時間實驗對動物的干擾。反復裝卸探針追蹤同批神經元時，視場旋轉角度小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。進口ultimainvestigator雙光子顯微鏡商家上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦。

2020年，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統介紹及其在臨床醫療診斷”的學術報告。學術報告由臨研所醫學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學信息科學技術學院副教授，畢業于北京大學物理系，獲學士、碩士學位，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經元和神經突觸清晰穩定的動態信號，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用，為未來即時病理、離體組織檢測、術中診斷等提供新的影像手段和分析方法。

生物樣品的三維觀察是了解細胞功能的重要方法之一。目前已有的三維熒光成像技術有光學顯微鏡、點陣照明和激光掃描顯微鏡(如共焦顯微鏡和雙光子顯微鏡)。其中，激光掃描顯微鏡利用轉盤可以進行多焦點激光掃描，提高了時間分辨率，有利于減少活細胞成像中的光損傷。本文主要實現可見光雙光子激發和多焦點激光掃描的結合，**終提高三維延遲掃描中的空間分辨率和成像對比度，這也是可見光雙光子激發(v2PE)在超高分辨率顯微鏡中的應用。雙光子顯微鏡成像技術及不同轉基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。

其實電子顯微鏡相比光學顯微鏡的重要優勢或意義不在于放大倍數，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。一般來說，觀察時，除了放大物體外，還需要將其與其他相鄰物體區分開來。如果兩個相鄰粒子的圖像在光學顯微鏡下，即使放大很大程度，也可能看到兩個相交的亮點(艾里斑)，沒有明顯的邊界(更不用說細節了)，說明分辨率不夠。沒有分辨率談放大是沒有意義的。光學顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，大約是光波波長的一半。通常稱之為光學顯微鏡的放大極限，但準確的說應該叫分辨率極限。原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實驗證明了電子的波動性，所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的。電子顯微鏡也有很多種，被攝體像REM。也有根據衍射規律觀察的電子顯微鏡，如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體，根據晶體的周期特性在倒易空間產生衍射像，借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實空間，即可得到真實的晶體表面像。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡分辨率是多少

在深度組織中以較長時間對細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡應用

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰和飛秒激光發揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬。基于以上分析，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態光源優勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡應用