《PNAS》解讀：分子互作機制

來源：發布時間：2024-11-05

分子互作機制

第一步，確定與下游蛋白分子的互作關系

為了探索USP8與GPX4是否互作，進行內源Co-IP實驗和GST pulldown實驗，發現USP8與GPX4互作（圖2a-c）。

第二步，USP8與GPX4蛋白結合的具體的位置

為了探索USP8與GPX4蛋白結合的位置，針對USP8構建不同的突變體分別進行Co-IP實驗，發現USP8通過 aa1-313、aa715-1118區域與GPX4結合（圖2d-e）。

第三步，USP8如何影響GPX4蛋白的穩定性

USP8是一個去泛素化酶。Co-IP分析發現，USP8能降低GPX4的泛素化水平，而酶非活性突變體USP8-c786a則不能去除GPX4的泛素鏈，表明USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（圖2f）。

圖2 USP8通過其去泛素化酶活性去除GPX4的泛素化（Ref. Fig 4/S4）

第四步，確定USP8去除GPX4的Ub K48鏈泛素化

眾所周知，泛素分子可以通過其七個賴氨酸(K)殘基中的一個(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)連接形成不同的泛素鏈。基于此，Co-IP分析發現GPX4被K27和K48連接的泛素化修飾（圖3a）。另外，Co-IP分析顯示USP8過表達降低GPX4上K48連接的泛素化，而不影響K27連接的泛素化（圖3b），表明USP8主要去除GPX4上K48連接的泛素化。體外去泛素化試驗表明（注：Ub(K48O)(只有完整的Lys48殘基的Ub)），USP8過表達以去泛素酶活性依賴性方式去除GPX4上K48連接的泛素化（圖3c）。

第五步，確定USP8去除GPX4蛋白泛素化位點

之前的研究已報道K48、K125、K127、K135和K151是GPX4的潛在泛素化位點。構建不同的泛素化位點突變體進行Co-IP分析，發現GPX4 K48R、K125R、K127R和K151R突變體K48連接的泛素化減少（圖3d）。另外，USP8過表達降低GPX4 WT、K125R、K127R和K151R突變體的泛素化，但未能消除GPX4 K48R突變體的泛素化（圖3e）。表明USP8主要去除GPX4上K48殘基的泛素化。

綜上所述，這些結果表明USP8作為穩定GPX4的關鍵上游調節因子，主要通過去除GPX4上K48連接的泛素化來防止其蛋白酶體介導的降解。